麻腮风水痘联合减毒活疫苗的稳定性观察

目的观察中试阶段制备的麻腮风水痘(measles,mumps,rubella and varicella,MMRV)联合减毒活疫苗的稳定性。方法将检定合格的3批中试阶段制备的MMRV联合减毒活疫苗分别置-20℃、2~8℃、室温(25℃)和37℃,定期对其病毒滴度进行检测;在0和18月进行鉴别试验、物理检查、水分检测、无菌检查、异常毒性检查、牛血清白蛋白残留量检测、抗生素残留量检测。结果 -20℃放置18个月,MMRV联合减毒活疫苗中麻疹、腮腺炎、风疹及水痘病毒滴度分别不低于4.55 lg CCID_(50)/ml、5.05 lg CCID_(50)/ml、3.80 lg CCID_(50)/ml和4.65 lg PFU/ml;2~8℃放置18个月,MMRV联合减毒活疫苗中麻疹、腮腺炎、风疹及水痘病毒滴度分别不低于4.05 lg CCID_(50)/ml、4.93 lg CCID_(50)/ml、3.80 lg CCID_(50)/ml和4.32 lg PFU/ml;25℃放置6周,MMRV联合减毒活疫苗中麻疹、腮腺炎、风疹及水痘病毒滴度分别不低于3.80 lg CCID_(50)/ml、4.43 lg CCID_(50)/ml、3.93 lg CCID_(50)/ml和3.87 lg PFU/ml;37℃放置4周,MMRV联合减毒活疫苗中麻疹、腮腺炎、风疹及水痘病毒滴度分别不低于3.80 lg CCID_(50)/ml、4.43 lg CCID_(50)/ml、3.93 lg CCID_(50)/ml和3.84 lg PFU/ml。其他各项指标检测结果均符合制造及检定规程要求。结论冻干MMRV联合减毒活疫苗稳定性良好。     

细胞工厂在麻腮风系列疫苗生产中的应用

目的利用细胞工厂培养麻疹、腮腺炎和风疹病毒,并制备麻腮风各单价及联合疫苗。方法应用40层细胞工厂培养原代鸡胚细胞和2BS细胞,制备麻疹、腮腺炎和风疹病毒原液(同时以15 L转瓶培养工艺作为对照),并制备麻腮风各单价及联合疫苗,按照《中国药典》三部(2015版)方法进行病毒滴度检测。结果细胞工厂制备的麻疹、腮腺炎和风疹病毒原液滴度分别为大于5.2、6.1和5.7 lgCCID_(50)/mL,高于转瓶工艺,且符合《中国药典》三部(2015版)相关规定;1个40层细胞工厂制备的病毒原液量相当于1个转瓶的4至8倍,产量较高。细胞工厂制备的多批次麻腮风各单价及联合疫苗的病毒滴度均符合《中国药典》三部(2015版)相关标准,且病毒滴度热稳定性下降均不超过1个lg。结论利用细胞工厂制备麻腮风各单价及联合疫苗的工艺稳定,重复性好,质量可控,可用于规模化生产。     

两种方法制备的水痘-带状疱疹病毒(Oka株)毒种感染2BS细胞的敏感性

目的用现有方法及新方法分别制备水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)(Oka株)毒种,比较两种方法制备的毒种对2BS细胞的感染复数及増殖动态差异。方法用现有方法(用含2%小牛血清的病毒维持液于-70℃条件下冻存Oka株毒种)和新方法(用含90%小牛血清的病毒冻存液于-196℃条件下冻存Oka株毒种)制备第47代Oka株VZV毒种,采用不同的MOI(0.000 5、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1)感染第37代2BS细胞,观察细胞病变(CPE)情况,收获不同MOI接种和培养不同时间点病毒制备疫苗,采用噬斑法检测疫苗原液、成品滴度以及37℃稳定性,确定两种方法制备的毒种对2BS细胞感染的最适MOI。结果现有方法制备毒种以0.01~0.1 MOI感染2BS细胞72 h后,病变达到高峰期;新方法制备毒种以0.001~0.01 MOI感染2BS细胞72 h后,病变达到高峰期。两种方法收获的病毒液制备的成品疫苗的病毒滴度为4.4~4.6 lg PFU/ml,37℃放置1周,病毒滴度3.8~4.0 lg PFU/ml;疫苗原液、成品滴度以及37℃稳定性无差异,均达到本公司水痘减毒活疫苗制造与检定规程制定的相关标准。结论现有方法和新方法制备的毒种最适MOI分别为0.01~0.1和0.001~0.01,新方法制备的毒种更适合水痘疫苗的生产。     

生物反应器培养Vero细胞制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗

目的在生物反应器中用微载体连续灌流培养Vero细胞,制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗。方法在50 L体积的生物反应器中,加入含10 g/L微载体的DMEM培养基,接种Vero细胞,当细胞密度约达5×10~6个/ml时,感染肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)毒种,接毒后72 h开始收获,连续收获17 d,收获的病毒原液经浓缩、灭活、Sepharose 4FF凝胶层析纯化后制备疫苗,检测病毒滴度、抗原含量及残余牛血清白蛋白、DNA、宿主蛋白含量,并接种新西兰家兔,检测疫苗效力。结果确定最佳Vero细胞接种浓度为1×10~5个/ml,病毒最佳MOI为0.015。利用优化后的培养条件收获的病毒滴度在6.5~8.0 log CCID_(50)/ml,且各项检测指标均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定。结论用生物反应器微载体灌流培养制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗的小试工艺可行。     

多层细胞工厂在水痘-带状疱疹减毒毒种(OKa株)传代中的应用

目的改进水痘-带状疱疹减毒活疫苗毒种(OKa株)培养方法,提高毒种的均一性及稳定性,延长保存时间。方法分别采用原培养方式(2 L方瓶培养法)和改进的培养方式(40层细胞工厂)制备水痘-带状疱疹病毒OKa株工作种子批,检测病毒滴度及-65℃以下保存1、3、6、12个月的稳定性,并用该种子批分别制备3批水痘减毒活疫苗后,进行疫苗成品的全面检定。结果 2 L方瓶培养法和40层细胞工厂制备的水痘-带状疱疹病毒工作种子批OKa-2015[1]C和OKa-2015[2]C的病毒滴度分别为6.1和6.0 lg PFU/ml;无菌试验、支原体检查、鉴别试验、外源因子检查结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求;-65℃以下保存12个月,滴度均无明显下降。两种培养方式各制备的3批疫苗成品的各项检定结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求,各批疫苗的病毒滴度及37℃热稳定性差别不明显。结论 40层细胞工厂制备水痘-带状疱疹病毒毒种(OKa株),-65℃以下长期保存具有稳定性,该培养方式可提高毒种的均一性,降低微生物污染风险。     

牛病毒性腹泻病毒的体外培养及其多克隆抗体的制备

目的体外培养牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV),并制备其多克隆抗体。方法制备牛肾原代细胞,并进行传代,建立细胞库。将BVD/MD Oregon C24毒种接种至牛肾细胞,进行体外传代,建立BVDV毒种库。按MOI=0.01将BVDV接种至牛肾细胞,制备BVDV病毒液,经Sepharose CL-2B凝胶柱纯化后,分别免疫家兔和健康海蓝白产蛋鸡,制备兔抗BVDV和鸡抗BVDV多克隆抗体,ELISA法测定效价。结果牛肾细胞体外传至20代生长状态均良好,传代稳定。建立的BVDV毒种库的毒力达7.50 CCID_(50)/mL,BVDV病毒液毒力达7.00 CCID_(50)/mL以上,纯化后毒力达5.00 CCID_(50)/mL以上。获得的兔抗BVDV和鸡抗BVDV多克隆抗体效价分别为1∶12 800和1∶6 400。结论体外成功培养了BVDV,制备的兔抗BVDV和鸡抗BVDV多克隆抗体效价较高,为BVDV检测试剂盒的研发奠定了基础。     

腮腺炎疫苗株Jeryl Lynn 1反向遗传系统的建立

目的建立腮腺炎疫苗株Jeryl Lynn 1(JL1)反向遗传系统,获得单一成分的拯救病毒JL1~R。方法将JL1全长c DNA基因序列分为7个片段(F1～F7),在F7片段的3′端引入丁型肝炎病毒核酶序列(hepatitis D virus ribozyme,Hdv RZ),分段合成后分别插入载体pT7-MCS3中,根据每段重叠区域的酶切位点拼接,构建全长表达质粒pT7-MCS3-MUV_(JL1)(HdvRz);同时构建表达腮腺炎病毒(mumps virus,MuV)核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、聚合酶蛋白(L)的3个辅助质粒;将全长表达质粒与3个辅助质粒及表达T7RNA聚合酶的质粒pCDIBP-T7RNAP共同电转染Vero细胞。对获得的病毒JL1~R进行测序、病毒滴度及中和抗体测定。结果拯救病毒JL1~R基因组SH及HN片段与疫苗株JL1对应片段的理论序列一致;JL1~R经Vero细胞连续传代培养2～10代病毒滴度均在6 lg CCID_(50)/mL以上;JL1~R与疫苗株S_(79)诱发抗MuV抗体滴度接近。结论成功构建了MuV疫苗株JL1的反向遗传操作系统,获得的单一成分拯救病毒JL1~R可作为腮腺炎疫苗株的备选株,解决了S_(79)疫苗生产中毒种及疫苗株的成分、纯度和批间一致性等问题,进一步提高了国内腮腺炎疫苗的免疫效果。     

不同病毒培养方式制备森林脑炎灭活疫苗的比较

目的比较3 L转瓶及14 L篮式生物反应器培养病毒制备的森林脑炎灭活疫苗的产量及质量。方法分别采用3 L转瓶及14 L篮式生物反应器培养Vero细胞,3 L转瓶培养细胞96 h后感染SZV株森林脑炎病毒(MOI=0.01、0.04、0.1及0.4),培养至80~96 h收获第1次,每隔48 h收获1次(500 m L/次);14 L生物反应器培养Vero细胞7 d后感染SZV株森林脑炎病毒(MOI=0.01、0.04、0.1及0.4),感染后96 h开始流加病毒维持液,并收获病毒液,每24 h收获10~15 L。两种培养方式收获的森林脑炎病毒液经超滤浓缩、β-丙内酯灭活、柱层析纯化后获得疫苗原液,并进行相关检定。结果 4种MOI感染Vero细胞,采用3 L转瓶方式培养可连续收获6~7次,病毒液产量为3~3.5 L,收获液平均滴度为7.4 lgLD_(50)/m L;采用14 L篮式生物反应器培养可连续收获14 d,病毒产量140~160 L,收获液平均滴度高达8.4 lgLD_(50)/m L。两种方法制备森林脑炎灭活疫苗原液各项质量指标均合格,且14 L篮式生物反应器制备原液的效力及蛋白含量优于3 L转瓶。结论应用生物反应器培养工艺制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的产量及质量高于转瓶培养工艺,本实验为生物反应器制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的大规模生产及工艺改进奠定了基础。     

利用DNA免疫技术制备麻疹病毒抗血清

目的利用DNA免疫技术制备特异性麻疹病毒抗血清,用于麻疹减毒活疫苗毒种以及含麻疹病毒疫苗的检定。方法以含麻疹病毒沪-191融合蛋白F和血凝素H基因的重组真核表达载体pGI-F和pGI-H作为免疫原,免疫家兔,制备麻疹病毒抗血清。采用细胞培养法检测抗血清细胞毒性,ELISA法检测抗体滴度,微量细胞病变法检测抗血清的特异性和中和效价。结果麻疹病毒抗血清细胞毒性小,与风疹病毒、腮腺炎病毒、水痘病毒均无交叉反应。抗血清的ELISA效价大于256 000,中和效价为1∶1 024,4倍稀释后仍能完全中和1×10~5 CCID_(50)/ml麻疹病毒。结论 DNA免疫方法可制备高效价、低细胞毒性的麻疹病毒抗血清,该血清可用于麻疹疫苗毒种及含麻疹疫苗的质量控制。     

甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞系W2上的适应性

目的研究甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞Walvax-2(W2)上的传代适应性,并确定其在W2细胞上培养的最适条件。方法将甲肝病毒YN5株P23代采用混合吸附的方式接种于T225细胞培养瓶,连续传至30代,检测各代次YN5D株病毒的抗原滴度及感染性滴度;将甲肝病毒YN5D株P29代以不同的MOI接种W2细胞,以最佳MOI接种细胞,确定最佳收毒时间;建立甲肝病毒YN5D株三级种子库,并进行检定。结果甲肝病毒YN5株连续传至30代,抗原滴度及感染性滴度均保持在10 240 EU/mL和7.00 lgCCID_(50)/mL以上;当接毒比例为0.5 MOI时,抗原滴度及感染性滴度均达到最高;当培养至24~28 d时,抗原滴度及感染性滴度均达到最高,分别为2 560 EU/mL和7.24 lgCCID_(50)/mL。三级毒种库各项检定结果均符合《中国药典》三部(2015版)要求。结论确定了甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞系W2上的传代适应性,并优化了细胞工厂的培养条件,为人二倍体甲肝疫苗临床申报样品的制备工艺奠定了基础。     

麻疹病毒长-47纯化株(2BS细胞)毒种库的建立

目的建立以人胚肺二倍体细胞(2BS)为基质的麻疹病毒长-47纯化株毒种库。方法将麻疹病毒长-47纯化株毒种(CEC)主代主种子批适应于2BS细胞,传至第4代和第8代,分别作为主种子批及工作种子批,对毒种进行鉴别试验、无菌试验、支原体检查、外源因子检查和病毒滴度检测,并对主种子批毒种进行猴体神经毒力试验和猴体免疫原性检测。将毒种连续传代,观察各代次病毒的收获时间,并测定病毒滴度,分析毒种的传代稳定性;将主种子批和工作种子批分别置于-20和-70℃保存,不同时间取样,检测病毒滴度,分析毒种保存温度稳定性;选取4个代次毒种(D4、D8、D15、D19)提取病毒核酸,扩增H基因序列,分析H基因在传代过程中的遗传稳定性。结果主种子批和工作种子批毒种鉴别试验、无菌试验、支原体及外源因子检查均符合《中国药典》三部(2010版)要求,病毒滴度分别为5.88和6.00 log CCID50/ml,主种子批毒种具有良好的安全性及免疫原性。麻疹病毒长-47纯化株毒种适应于2BS细胞后,收获病毒时间一般在6~7 d,病毒滴度稳定在5.5~6.5 log CCID50/ml之间。主种子批和工作种子批病毒于-20和-70℃保存10个月,病毒滴度无明显变化。D4~D19代病毒无核苷酸发生改变,与麻疹病毒Chang-47(Gen Bank登录号:EF033071)比对结果显示,D4~D19代病毒核苷酸序列21 nt由G→C,属于同义突变,同源性达99.9%。结论建立了麻疹病毒长-47纯化株(2BS)毒种库,并按照《中国药典》三部(2010版)要求进行了全面检定,为制备以人胚肺二倍体细胞为基质的麻疹减毒活疫苗奠定了基础。     

北京株(VZV84-7)水痘病毒在麻疹-腮腺炎-风疹-水痘联合减毒活疫苗中的稳定性

目的观察北京株(VZV84-7)水痘病毒在麻疹-腮腺炎-风疹-水痘(measles-mumps-rubella-varicella,MMRV)联合减毒活疫苗中的稳定性。方法将4批MMRV联合减毒活疫苗成品分别置37℃保存4周、2~8及-15~-20℃保存24个月,采用蚀斑形成单位(plaque forming unit,PFU)试验检测不同时间点疫苗中水痘病毒滴度。将水痘病毒原液于-80℃反复冻融1、2、3次后,分别与麻疹、腮腺炎、风疹各单价疫苗原液按一定比例配制成MMRV联合减毒活疫苗,进行冻干,采用PFU试验分别测定冻干前、冻干后基础水痘病毒滴度及冻干后于37℃热稳定1周的水痘病毒滴度。结果 4批MMRV联合减毒活疫苗成品于37℃保存4周后,水痘病毒滴度下降范围为0.5~0.7 lg PFU/ml;于2~8℃保存24个月,水痘病毒滴定最高达4.6 lg PFU/ml,最低为4.4 lg PFU/ml;于-15~-20℃放置24个月,水痘病毒滴度基本保持不变,均达合格标准(不低于3.6 lg PFU/ml)。水痘病毒原液经1、2、3次冻融后制备的MMRV,通过37℃热稳定1周,水痘病毒滴度分别为4.9~4.6、4.6~4.4、4.5~4.3 lg PFU/ml,均达到合格标准(不低于3.6 lg PFU/ml)。结论北京株(VZV84-7)水痘病毒在MMRV联合减毒活疫苗中稳定性良好。     

细胞工厂在制备口服脊髓灰质炎减毒活疫苗中的应用

目的采用细胞工厂替代转瓶培养Sabin株脊髓灰质炎病毒,制备脊髓灰质炎减毒活疫苗。方法用细胞工厂和15 L转瓶分别培养人二倍体细胞(2BS),扩增至36代后,分别接种0.20 MOI的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎工作代毒种,待细胞病变达100%时收获病毒液,加入保护剂(4.5 mol/L氯化镁溶液),制备单价疫苗,分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个型别的单价疫苗按照病毒数10∶1∶6的比例混匀,制备成三价疫苗半成品,分装入1 ml西林瓶中(每瓶为10人份剂量),即为疫苗成品。采用微量滴定法测定疫苗原液及成品的病毒滴度,同时进行其他各项检定,并考察疫苗成品的稳定性。结果采用相同的感染复数接种病毒,细胞工厂制备的3个型别疫苗原液的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗原液,Ⅰ型平均滴度高0.17 log10CCID50/ml,Ⅱ型平均滴度高0.33 log10CCID50/ml,Ⅲ型平均滴度高0.27 log10CCID50/ml;细胞工厂制备的疫苗成品3个型别的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗,三价疫苗的平均滴度均高于6.24 log10CCID50/ml,符合国内外标准;疫苗原液及疫苗成品的其他各项检定均合格;细胞工厂制备的3批疫苗成品于37℃放置2 d,疫苗的总病毒含量不低于6.24 log10CCID50/0.1 ml,且病毒滴度下降未超过0.5 log10CCID50/0.1 ml,于2~8℃放置9个月,疫苗的总病毒含量仍不低于6.24 log10CCID50/0.1 ml,均符合WHO的标准要求。结论利用细胞工厂替代转瓶培养2BS细胞制备脊髓灰质炎减毒活疫苗,可获得高于转瓶培养3个型别疫苗的滴度,且工艺稳定,质量可控,可用于规模化脊髓灰质炎减毒活疫苗的生产。     

聚乙烯吡咯烷酮稳定剂风疹减毒活疫苗的研制

目的研制安全有效的不含人血白蛋白稳定剂的风疹减毒活疫苗。方法将风疹减毒活疫苗毒种RA27/3株按适当比例接种单层人二倍体细胞MRC-5株,使用无血清、无蛋白的CDM培养基培养病毒,收获病毒液,加入聚乙烯吡咯烷酮作为病毒稳定剂,制备疫苗原液,加入冻干保护剂,制备5批冻干疫苗,进行各项检定。另取1批原液样品,分别加入聚乙烯吡咯烷酮和人血白蛋白作为病毒稳定剂,制成疫苗,进行各项检测。结果5批疫苗各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求。同1批原液制备的聚乙烯吡咯烷酮与人血白蛋白稳定剂疫苗的病毒滴度和热稳定性无明显差异。37℃放置6周,两种稳定剂疫苗的病毒滴度均为3.63LgCCID50/ml。结论聚乙烯吡咯烷酮稳定剂风疹减毒活疫苗质量符合《中国药典》三部(2005版)的要求。     

水痘-带状疱疹减毒活疫苗毒种(Oka株)制备方法的改进

目的改进水痘-带状疱疹减毒活疫苗毒种(Oka株)的制备方法,提高毒种的病毒滴度及稳定性,延长保存时限。方法分别采用原法(病毒吸附感染法)和改进的方法(病毒混合感染法)制备水痘-带状疱疹病毒Oka株工作种子批,采用蚀斑法检测病毒滴度及-70℃保存0、1、6、12个月的稳定性,并各制备出3批疫苗进行全面检定。结果采用病毒混合感染法和病毒吸附感染法制备的毒种病毒滴度分别为6.6和6.5 lgPFU/ml,病毒混合感染法制备的毒种在-70℃以下保存12个月,病毒滴度无明显下降;病毒吸附感染法制备的毒种-70℃以下保存6个月,病毒滴度下降明显。两中方法制备的水痘减毒活疫苗成品的各项检定结果均符合要求,病毒滴度及37℃稳定性无明显差异。结论采用病毒混合感染法制备的毒种提高了病毒滴度和-70℃保存的稳定性。     

水痘-带状疱疹病毒疫苗株在Vero细胞中的传代适应

目的探索水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗株在Vero细胞中的传代适应及大量制备抗原的可行性。方法以VZV疫苗株在Vero细胞中传代适应,并检测适应株的生物学性状,采用15L旋转培养瓶培养,大量制备VZV ELISA抗原,并检测抗原的特异性。结果VZV疫苗株在Vero细胞中传代至第9代时,CPE明显增多,病毒滴度从2～3logPFU/ml提高到不低于4·2logPFU/ml。所制备毒种的适宜MOI为0·01,在72h左右收获的病毒滴度较高。毒种在-70℃保存1年后,病毒滴度未显著降低。抗VZV阳性血清检测证实制备的抗原具有较好特异性,抗原最适稀释浓度为1:4000。结论VZV疫苗株在Vero细胞中能传代适应,并可用15L瓶旋转培养大量制备VZV抗原。     

兽用灭活纯化狂犬病疫苗生产工艺的优化

目的优化兽用灭活纯化狂犬病疫苗的生产工艺。方法建立BHK21C13细胞主细胞库、工作细胞库,狂犬病病毒疫苗株LEP-Flury主种子批、工作种子批,并进行鉴定。优化悬浮培养工艺参数,并分析病毒原液浓缩、纯化和灭活过程中抗原及成品的稳定性。结果主细胞库、工作细胞库无外源因子污染,细胞形态、生长良好;狂犬病病毒主种子批和工作种子批无外源因子污染,病毒滴度最高可达107.8logLD50/ml。采用15L生物反应器,在优化的培养工艺条件下,细胞密度可达4.5×106个/ml,病毒按0.3MOI接种,灌流培养5次,病毒滴度平均可达106.8logLD50/ml。病毒原液合并后,经750KD中空纤维柱30倍浓缩,Sepharose Fast Flow6层析柱纯化,1/4000β-丙内酯灭活,期间加入稳定剂,纯化疫苗效价平均达(5.03±1.84)IU/头份,纯化的抗原量达(11.75±0.70)μg/头份,在4℃可保存24个月,在37℃可保存30d,在45℃可保存12h。结论优化的兽用灭活狂犬病疫苗的生产工艺可提高疫苗的安全性、有效性及稳定性。     

不同生产工艺制备水痘减毒活疫苗(VZV 84-7株)的比较

目的采用细胞工厂替代传统转瓶工艺制备水痘减毒活疫苗(VZV 84-7株)。方法分别用细胞工厂和3 L转瓶培养2BS细胞,制备水痘减毒活疫苗(VZV 84-7株)各6批,采用Countstar全自动细胞计数仪进行细胞计数,并以计数结果中的单位面积细胞数、成活率及消化后细胞的平均直径为指标,考察细胞质量,同时采用蚀斑法检测原液、成品及成品37℃放置7 d后(热稳定性)的病毒滴度。结果采用细胞工厂连续制备的6批2BS细胞的平均单位面积细胞数、细胞平均成活率均略优于3 L转瓶培养工艺,平均直径变动范围小于3 L转瓶;细胞工厂制备的6批疫苗,平均原液滴度为5.58 lg PFU/ml,平均成品滴度为4.78 lg PFU/0.5ml,37℃放置7 d后的平均病毒滴度为4.13 lg PFU/0.5ml,优于3 L转瓶。结论利用细胞工厂制备水痘减毒活疫苗(VZV 84-7株),可获得更高滴度病毒液,降低疫苗生产过程中的劳动强度及污染风险,并提高了疫苗产量及质量的稳定性,适合于水痘减毒活疫苗(VZV 84-7株)的规模化生产。     

应用固定床式生物反应器大规模制备慢病毒

目的研究应用固定床式生物反应器制备慢病毒的工艺。方法分别在2个1.5 L固定床式生物反应器中,加入50 g片状载体,接种293T细胞,当细胞生长3 d,细胞密度达1.0~1.5×10~7个/m L时,使用聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)作为转染介质转染质粒制备慢病毒;分别根据葡萄糖消耗进行换液培养收获和连续灌流收获病毒原液,采用逐孔稀释滴度测定法检测病毒滴度。结果换液培养共收获6 L慢病毒原液,收获时间持续5 d,病毒滴度最高可达5.13×10~7 TU/m L;连续灌流培养共收获9 L慢病毒原液,收获时间持续8 d,病毒滴度最高可达2.62×10~8 TU/m L。结论用固定床式生物反应器连续灌流培养可用于临床级别的慢病毒制备。     

乙型脑炎病毒在Vero细胞上的传代适应性及毒种库的建立

目的分析乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)在Vero细胞上的传代适应性,进行培养条件及接种方式的优化,并建立毒种库。方法将JEV P3株在Vero细胞上连续适应性传至20代(P3V1~P3V20),采用小鼠法检测P3V2、P3V3、P3V4的病毒滴度。优化JEV静置培养条件(维持液p H值、培养温度、MOI)及接种方式(单层接种法、混合接种法),并进行培养规模的放大。采用RT-PCR法扩增P3V0、P3V1、P3V5、P3V10、P3V15及P3V20代病毒的E基因片段,并进行测序分析。建立JEV毒种库,并进行全面检定。结果 JEV在Vero细胞上传代适应性良好,各代次病毒滴度均大于8.5 lg LD50/ml。最适培养条件为:病毒维持液p H值为7.6,培养温度为34℃,病毒MOI为0.1;最佳接种方式为:单层接种法。在不同培养规模时,病毒滴度变化较小,且均维持在较高水平。P3V0、P3V1、P3V5、P3V10、P3V15及P3V20各代次间E基因片段同源性为100%,传代稳定性良好。建立的毒种库的鉴别试验、无菌检查、支原体检查、病毒滴定、病毒外源因子检查及免疫原性检查结果均符合《中国药典》三部(2010版)相关要求。结论已完成JEV在Vero细胞上的适应性传代培养,并成功建立毒种库,为实现以Vero细胞为基质的JEV疫苗的研发奠定了基础。