淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体多重荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用

目的建立淋病奈瑟菌(Neisseria agonorrhoeae,NG)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)、细小脲原体(Ureaplasma parvum,UP)多重荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)检测方法。方法选择NG保守基因porA、解脲支原体(Ureaplasma urealytieum,UU)保守基因ure及CT保守基因trp作为目标检测基因,设计引物及TaqMan探针,制备重组质粒标准品,绘制标准曲线,建立多重FQ-PCR检测方法,并验证其敏感性、特异性及重复性。用建立的方法对203份泌尿生殖道感染NG、CT、UP的临床样本进行同步检测,并与单重FQ-PCR法、常规PCR法及基因测序结果进行比较。结果重组质粒标准品经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;建立的标准曲线起始DNA拷贝数与Ct值之间的线性关系良好,相关系数为0.998~1.000;该方法检测NG、CT和UP的灵敏度均可达102copies/ml,检测范围可达109~102copies/ml,相关系数分别为1.000、0.999和0.995;不与生殖道其他菌群如阴道霉菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、人型支原体、单纯疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型及人乳头瘤病毒(16/18型)发生交叉反应;检测的203份样本中,多重FQ-PCR检测NG、CT、UP的阳性检出率分别为34.48%、30.54%、18.71%,与单重FQ-PCR法、基因测序法比较,差异无统计学意义(P0.05),3种方法阳性检出率均高于常规PCR法;与基因测序法相比,多重FQPCR法灵敏度为100%,3种病原体检测特异性均高于98.50%。结论已成功建立NG、CT、UP多重FQ-PCR检测方法,该法检测时间短,特异性强,灵敏性高,适合于临床快速诊断。     

腮腺炎病毒临床口漱液样本的一步法实时荧光定量PCR检测

目的建立腮腺炎病毒(mumps virus,MuV)临床口漱液样本一步法荧光定量PCR检测方法,为腮腺炎的临床诊断及免疫防控提供依据。方法对101份采集自中国南部3个省、自治区(云南、四川、广西)的临床疑似腮腺炎患者口漱液样本,分别采用细胞培养-MuV特异的巢式PCR法及TaqMan探针Real-time PCR法进行检测,比较两种方法检测MuV的灵敏性。结果细胞培养-MuV特异的巢式PCR法共检出31份MuV阳性样本,系统进化分析表明,该31株MuV均属于F基因亚型;TaqMan探针Real-time PCR法共检出41份MuV阳性样本,其中包含了细胞培养-MuV特异的巢式PCR法检出的31份阳性样本,TaqMan探针Real-time RT-PCR法对MuV的检出率(40.59%)高于传统细胞培养-巢式PCR法的检出率(30.69%)。结论 TaqMan探针Real-time PCR法的灵敏性、特异性和简便性均优于传统的细胞培养-MuV特异的巢式PCR法,可应用于腮腺炎的临床诊断及免疫防控。     

对稽留流产的病因分析探讨

目的探讨孕妇沙眼衣原体(CT)和解脲支原体(UU)感染与稽留流产的关系及其发病机制,并试图寻找预防和降低稽留流产发生的方法和途径。方法分别采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)的方法和细胞培养的方法对稽留流产患者340例和人工流产的孕妇176例的宫颈分泌物和妊娠产物同时进行了CT、UU的检测,并进行与稽留流产的相关分析。结果稽留流产组和人工流产组比较,宫颈分泌物标本:采用培养法,稽留流产与CT、UU感染及CT+UU混合感染有关(P<0.05)。采用PCR法,稽留流产组与CT+UU混合感染有关(P<0.05),与单纯CT及UU感染无关(P>0.05);妊娠产物标本:采用培养法,稽留流产与CT、UU感染有关(P<0.05),与CT+UU混合感染无关,但差异接近显著性水平(P=0.053)。采用PCR法,稽留流产与CT+UU混合感染有关(P<0.05),与单独CT、UU感染无关(P>0.05)。结论孕妇沙眼衣原体和解脲支原体感染与稽留流产有着密切关系。     

快速细胞培养法在呼吸道合胞病毒感染早期诊断中的应用

目的建立检测呼吸道合胞病毒(RSV)的快速细胞培养法,并应用于呼吸道合胞病毒感染的早期诊断。方法采用自制的抗RSV的单克隆抗体,经快速细胞培养法和直接涂片法检测165份急性下呼吸道感染的婴幼儿鼻咽分泌物及咽拭子中RSV,并与病毒分离培养比较,再将自制试剂盒与进口呼吸道病毒荧光检测试剂盒检测结果进行比较,探讨其临床实用性。结果57份咽拭标本中,1份快速细胞培养法及直接涂片法检测均为阳性,阳性率1.8%,未分离到病毒。108份鼻咽分泌物中,快速细胞培养法检出21份阳性,阳性率19.4%。直接涂片法检测出14份阳性,阳性率13%,病毒分离培养法检出阳性12份,阳性率11%。快速细胞培养法与其他两种方法相比,阳性检出率差异有显著意义。自制试剂盒与进口试剂盒检出40份鼻咽分泌物标本,阳性率均为35%。结论将直接涂片法与快速细胞培养法同时应用于RSV感染的早期诊断,既能及时提供检测结果,又能提高诊断的敏感性,是对RSV感染进行早期诊断的实用方法。     

应用PCR法检测患者尿中人巨细胞病毒DNA

在人巨细胞病毒(HCMV)基因组早期蛋白基因处设计了一对引物,通过链聚合酶反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增一段长106bp的特异性序列,用来检测样品中HCMV DNA。以此方法检测正常儿童尿标本阳性为15％(3/20),白血病患者尿阳性为76.2％(16/21),肾移植患者尿阳性为40％(13/33)。同时对部分标本进行了Dig标记的HCMV DNA探针法检测,结果PCR法检测的阳性率比Dig标记探针法高。     

基于微生物学的速食食品致病菌检验研究

分析基于微生物学的速食食品致病菌检验检测结果,总结相应的检验方法.采用传统细菌分离培养法和实时荧光定量PCR法进行检验.对两种检验方法下的致病菌阳性检出情况进行统计,计算出总阳性率.并对两组检验所耗费的时间进行记录,计算出平均用时结果.经统计与组间比较,实时荧光定量PCR法的样本阳性检出率为11.00％,较传统细菌分离...     

人巨细胞病毒基因克隆及分子探针的临床应用

以 PuC18为载体克隆了人巨细胞病毒(HCMV)AD169株 ECoRI 部分基因组片段。以α~(-32)P 标记的 ECoRI-Z 片段为探针,对尿、脐带血和宫颈分泌物等标本进行了 HCMV DNA 的临床诊断分析。该探针可以检测出12pg 水平的 HCMV DNA,但与人单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSVI)和人单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSVⅡ)、λ噬菌体、Puc18载体 DNA 等不杂交。以斑点杂交法检测了正常新生儿尿标本50份和临床诊断为新生儿黄疸的尿标本109份,其阳性率分别为8%和36%;此外还检测了172份随机收集的新生儿脐带血白细胞 DNA,其阳性率为15%,说明了我国新生儿 HCMV 感染的严重性。检测结果亦证实患宫颈炎和宫颈癌的患者,HCMV DNA 检出率明显高于正常妇女,说明分子杂交法可用于各种临床标本 HCMV DNA 的检测。     

在职体检妇女生殖道UU(支原体)及其分群分型的调查

目的了解无症状体检妇女下生殖道UU携带情况和定量值。方法应用FQ-PCR方法进行宫颈分泌物UU检测。结果无症状体检妇女509例,平均年龄为(40.4±7.1)岁(20～55岁),UU阳性185例占36.4%(其中UU与CT混合感染22例占4.3%),此外,检出CT阳性40例占7.9%。结论在UU定量值高的情况下,临床上可考虑给予药物治疗。     

重庆地区5岁以内儿童腹泻病毒病原及流行病学特点

目的了解重庆地区5岁以内儿童腹泻病毒病原及流行病学特点。方法收集重庆医科大学附属儿童医院2010年8～11月就诊的5岁以内腹泻患儿的粪便标本共500份,采用胶体金法检测A组轮状病毒(Rotavirus,RV),RT-PCR法检测B、C组RV、诺如病毒(Norovirus,NV)GⅠ和GⅡ、肠道腺病毒(Adenovirus,ADV)、札如病毒(Sapovirus,SLV)和星状病毒(Astrovirus,ASV),取NV和SLV阳性PCR产物测序,并对病毒基因进行分型。采用MEGA 5.05软件构建进化树,Kimura’s two-parameter法计算遗传距离,邻接法(Neighbor-joining)boot-strap重复检验1 000次。结果 500份标本中,检测到A组RV阳性标本134份,阳性率为26.8%;NV GⅡ型阳性标本132份,阳性率为26.4%;ADV阳性标本31份,阳性率为6.2%;SLV阳性标本9份,阳性率为1.8%;ASV阳性标本1份,阳性率为0.2%;未检测到B、C组RV和NV GⅠ型。随机选择22份NV阳性标本进行测序及基因分型,其中GⅡ/4占绝对优势,其次为GⅡ/6、GⅡ/2、GⅡ/3和GⅡ/7。SLV可分为4个基因亚型,其中GⅠ/1为优势株,其次为GⅠ/2、GⅡ/1和GⅠV 1。结论重庆地区5岁以下儿童腹泻以病毒感染为主,RV是主要的病原体,其次为NV、ADV、SLV和ASV。     

HCV Ag或HCV RNA试剂用于筛查丙型肝炎病毒感染样本的性能比较

目的比较丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)抗原(HCV Ag)与HCV RNA试剂检测HCV感染的性能。方法应用ABBOTT ARCHITECT HCV Ag和Abbott RealTime HCV RNA试剂分别检测经Ortho和DiaSorin公司抗HCV EIA试剂以及CHIRON公司RIBA HCV 3.0 SIA和MP Biomedicals Asia Pacific Pte公司确证试剂检测的304份血浆样本(抗-HCV阳性139份,抗-HCV阴性165份)。结果 139份抗-HCV阳性样本中,HCV RNA和HCV Ag试剂的阳性检出率分别为54.0%(75/139)和27.3%(38/139),HCV RNA试剂敏感性明显高于HCV Ag试剂(P0.01);检测165份抗-HCV阴性样本中,HCV RNA和HCV Ag试剂检测均为阳性的样本有5份,分别检出7份和2份单独阳性样本,特异性分别为7.3%(12/165)和4.2%(7/165),差异无统计学意义(P0.05);应用HCV Ab+HCV RNA或HCV Ab+HCV Ag筛查HCV感染,阳性检出率分别为49.7%(151/304)和48.0%(146/304),差异无统计学意义(P0.05)。在94份HCV Ag和HCV RNA阳性样本检测中,HCV Ag试剂阳性率随样本HCV RNA载量的升高而增加,HCV RNA载量与检测HCV Ag阳性率呈正相关。结论 HCV Ag或HCV RNA作为HCV筛查的补充试验方法,可有效降低HCV Ab窗口期的漏检率。