人GINS2基因重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的利用AdEasy系统构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,并进行鉴定。方法以pcDNA3.1-GINS2质粒为模板,PCR扩增GINS2基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2,经双酶切及测序鉴定正确的阳性质粒与骨架质粒pAdEasy-1同时转化感受态大肠杆菌BJ5183,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAdE-GINS2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-GINS2,大量扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。Western blot法检测重组腺病毒感染的人HL60细胞中GINS2蛋白的表达,MTT法检测重组腺病毒感染对HL60细胞增殖的影响。结果重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2经双酶切及测序证明构建正确;经酶切鉴定证明重组腺病毒质粒pAdE-GINS2构建正确;经PCR鉴定证明重组腺病毒Ad-GINS2包装成功,经3轮扩增后病毒滴度可达1.35×1012IU/ml;与空载体感染及未感染的HL60细胞相比,重组腺病毒感染的HL60细胞内GINS2蛋白的表达及细胞增殖水平均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,感染人HL60细胞后可促进其增殖,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

重组腺病毒Ad-PML(NLS)-的构建及鉴定

目的构建携带PML(NLS-)基因的重组腺病毒,并观察其对白血病K562细胞增殖的影响。方法以质粒pCMV-HA-PML(NLS-)为模板,PCR扩增PML(NLS-)基因,与穿梭质粒pAdTrace-TO4连接,构建重组穿梭载体pAdTrace-TO4-PML(NLS-),经PmeⅠ酶切线性化后,转化入感受态BJ5183细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-),经PacⅠ酶切后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,检测其滴度。采用RT-PCR法和Western blot法分别检测重组腺病毒中PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;将重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测其对细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-)经PCR和单酶切鉴定,证明构建正确;经4轮扩增,重组腺病毒的滴度为1×1010pfu/ml;Ad-PML(NLS-)携带的PML(NLS-)能够在AD293细胞中稳定表达;与未感染组和空载病毒感染组相比,重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染的K562细胞的增殖活力明显增强(P<0.05)。结论成功构建了重组腺病毒Ad-PML(NLS-),其可促进K562细胞的增殖,表明PML(NLS-)可能具有促癌基因的作用。     

Pre-miR-10a重组腺病毒质粒的构建及其在K562细胞中的表达

目的构建pre-miR-10a(miR-10a前体)重组腺病毒表达质粒,感染K562细胞,并检测其基因表达水平。方法化学合成pre-miR-10a基因序列,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,将构建正确的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV pre-miR-10a与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183感受态细胞,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-pre-miR-10a,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒,经4轮扩增后检测病毒滴度。收集病毒后,以100 MOI感染K562细胞,RT-PCR法检测miR-10a基因的转录水平。结果重组腺病毒质粒pAd-pre-miR-10a经PacⅠ酶切,证明带有目的基因的重组腺病毒穿梭质粒已整合到腺病毒基因组中,4轮扩增后腺病毒滴度为1.5×1011pfu/ml,可高效感染K562细胞,感染效率达90%以上;重组腺病毒Ad-pre-miR-10a感染的K562细胞中miR-10a基因转录水平明显升高,过表达率为150.82%。结论已成功构建重组腺病毒表达质粒pAd-pre-miR-10a,并可在K562细胞中高效表达,为进一步从体内和体外水平研究其抗白血病效应奠定了基础。     

重组腺病毒Ad-NLS-RARα的构建及其在K562细胞中的表达

目的构建含NLS-RARα基因的重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并检测其在K562细胞中的表达。方法以质粒pGBKT7-PML-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα基因,与穿梭质粒dTrace-TO4连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TO4-NLS-RARα,经PmeⅠ酶切线性化后,转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒pAd-NLS-RARα,经PacⅠ酶切线性化后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-NLS-RARα,经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度,并进行PCR及测序鉴定;将重组腺病毒感染K562细胞,采用流式细胞术测定感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NLS-RARα在K562细胞中的转录及表达水平。结果重组腺病毒Ad-NLS-RARα经4轮扩增后,滴度可达6.9×108pfu/ml,PCR及测序鉴定证明构建正确,对K562细胞的感染效率可达70%左右;重组腺病毒Ad-NLS-RARα携带的NLS-RARα基因可在K562细胞中高效表达。结论已成功构建了重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并在K562细胞中高效表达了NLS-RARα基因。     

Musashi2对白血病K562细胞体外侵袭能力的影响

目的探讨Musashi2(Msi2)对白血病K562细胞体外侵袭能力的影响。方法将靶向Msi2基因的si-RNA1、siRNA2及阴性对照序列转染K562细胞,同时设空白对照组(未转染的K562细胞)。实时荧光定量PCR法及Western blot法分别检测K562细胞中Msi2基因m RNA转录及蛋白的表达水平;经细胞生长曲线观察细胞体外增殖能力;细胞黏附试验检测K562细胞体外黏附能力;Transwell试验检测K562细胞体外迁移及侵袭能力。结果与阴性对照组及空白对照组比较,Msi2-1及Msi2-2组K562细胞中的Msi2基因m RNA转录及蛋白的表达水平显著下降(P<0.05),体外黏附、迁移、侵袭能力明显减弱(P<0.05)。结论抑制Msi2的表达可显著抑制白血病K562细胞的体外侵袭能力,本实验为进一步研究Msi2在白血病发生发展中的调控机制奠定了基础。     

Notch2胞内段基因过表达对K562细胞增殖的影响及其机制

目的探讨外源性Notch2胞内段基因过表达对慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)细胞株K562增殖的影响及其机制。方法将携带Notch2胞内段(ICN2)基因的质粒转染K562细胞,MTT法检测细胞的增殖;流式细胞仪检测细胞的细胞周期分布;RT-PCR检测Notch2基因全长mRNA的转录,Western blot检测Notch2蛋白的表达;RT-PCR检测Notch通路下游靶基因Hes1、Hey1及细胞增殖、凋亡相关基因numb、Bcl-2、NF-κB和TGF-β1的mRNA转录水平。结果与未转染组相比,转染组K562细胞数量减少,增殖显著受抑(P<0.01);转染48 h后的K562细胞G1期细胞比例显著增多(P<0.01),S期细胞比例显著减少(P<0.01);Notch2基因mRNA及下游靶基因Hes1和Hey1 mRNA转录水平均明显增强(P<0.01),Notch2蛋白表达量增加(P<0.01);numb基因mRNA转录水平无变化;Bcl-2表达下调,NF-κB和TGF-β1表达上调。结论Notch2胞内段基因过表达可抑制K562细胞增殖,其机制可能是通过上调TGF-β1和NF-κB基因表达及下调Bcl-2基因表达,将细胞阻滞于G1期来实现的。     

JTV1基因真核表达质粒的构建及其在K562细胞中的表达

目的 构建JTV1基因真核表达质粒并稳定转染人白血病细胞系K562,检测转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平及其对K562细胞增殖的影响。方法从人外周血单个核细胞中克隆JTV1基因,并将其插入pcDNA3.1表达载体中,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1,经脂质体介导转染K562细胞,采用RT-PCR和Western blot法鉴定转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测JTV1稳定表达对K562细胞增殖的影响。结果重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1经双酶切及测序证实,目的基因已插入质粒中;人JTV1基因能在K562细胞中稳定表达;JTV1具有抑制K562细胞增殖的作用。结论已成功构建了JTV1基因真核表达质粒,并获得了稳定表达人JTV1基因的K562细胞克隆,为进一步研究人JTV1基因的功能及其与白血病细胞增殖及凋亡的相关性提供了细胞模型。     

GINS2基因siRNA真核表达质粒的构建及其对NB4细胞凋亡的影响

目的构建GINS2基因siRNA真核表达质粒,并检测其对NB4细胞凋亡的影响。方法人工合成针对GINS2基因的4组siRNA干扰序列和1组无同源性的序列,测序鉴定后转染低传代人早幼粒细胞系NB4细胞,经G418筛选后,通过QRT-PCR、Western blot检测重组质粒对NB4细胞中GINS2基因mRNA转录水平和蛋白表达水平的影响;流式细胞术检测NB4细胞的凋亡情况。结果 5组重组质粒经测序证明构建正确,4组干扰质粒转染NB4细胞后,细胞中GINS2基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均有所降低,其中干扰组1基因干扰率达50%,蛋白相对表达量为56%;干扰组1细胞凋亡率为32.54%,较正常对照组和NC组明显上升(P<0.01)。结论成功构建了GINS2基因siRNA真核表达质粒,抑制GINS2基因的表达可促进NB4细胞的凋亡,为进一步研究GINS2基因在白血病中的作用奠定了基础。     

T-cadherin基因通过雄激素受体通路对前列腺癌LNCa P细胞增殖的抑制作用

目的分析前列腺癌组织中T-cadherin基因mRNA转录水平,探讨T-cadherin基因通过雄激素受体(androgen receptor,AR)通路抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖的作用。方法收集前列腺癌及癌旁相应正常组织各60份,实时荧光定量PCR检测组织中T-cadherin mRNA转录水平;将培养24 h的前列腺癌LNCaP细胞分为腺病毒GFP组、腺病毒GFP-T-cadherin组及空白对照组(不含腺病毒),CCK-8法检测T-cadherin对前列腺癌LNCaP细胞增殖的影响,Western blot法检测过表达T-cadherin后前列腺癌LNCaP细胞中AR及前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)蛋白表达水平,并检测不同组别LNCaP胞浆及胞核中AR蛋白表达水平。结果 T-cadherin基因在癌组织中较癌旁组织mRNA转录水平明显减少(P 0. 01),其转录水平与前列腺癌的分期、格里森评分及分化均有关(P均0. 05);与空白对照组比较,腺病毒GFP-T-cadherin组能抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖(P 0. 05),而T-cadherin过表达能下调LNCaP细胞中AR及下游靶基因PSA的表达水平(P均0. 05)。结论前列腺癌组织中T-cadherin基因mRNA转录水平明显减少,其过表达能通过AR通路抑制前列腺癌LNCaP细胞的增殖,本研究为前列腺癌的治疗提供了新的靶点。     

海兰褐鸡卵泡颗粒细胞微管去稳蛋白2过表达对Ras-MAPK信号通路的影响

目的探讨微管去稳蛋白2(stathmin-2-like protein,STMN2)过表达对海兰褐鸡卵泡颗粒细胞中Ras-MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号通路的影响。方法将STMN2腺病毒过表达载体以MOI为350 pfu/cell转染原代培养的蛋鸡卵泡颗粒细胞模型,设培养液组和腺病毒空载体组为对照组,转染48 h后,收集细胞总RNA和总蛋白,荧光定量PCR法检测各组细胞STMN2 mRNA水平及STMN2过表达对颗粒细胞分泌的细胞外调节蛋白激酶1(extracellular regulated protein kinases1,erk1)、erk2、大鼠肉瘤蛋白(rat sarcoma,ras)和转录激活因子ETS样蛋白1(ets-like protein 1,elk-1)的影响,Western blot法检测各组STMN2蛋白水平及STMN2过表达对颗粒细胞分泌的erk1、erk2、磷酸化erk1(p-erk1)、p-erk2、ras和elk-1的影响。结果与培养液组和腺病毒空载体组比较,STMN2过表达载体组STMN2 mRNA及蛋白表达水平均明显升高(P0.01);除elk-1蛋白表达水平差异无统计学意义(P0.05)和elk-1 mRNA水平显著增加(P0.05)外,STMN2过表达使颗粒细胞分泌的目的基因mRNA与蛋白表达水平均极显著增加(P0.01)。结论 STMN2可通过Ras-MAPK信号通路影响蛋鸡卵泡颗粒细胞周期。     

干扰素γ对肾癌786-0细胞增殖的抑制作用及其机制

目的探讨干扰素γ(interferonγ,IFNγ)对人肾癌786-0细胞增殖的抑制作用及其可能的机制。方法用不同浓度(1 000、2 000、3 000、4 000和5 000 U/ml)的IFNγ作用人肾癌786-0细胞不同时间,CCK-8法检测细胞增殖抑制率;将786-0细胞分为试验组(加入900 U/ml IFNγ)和细胞对照组(未作任何处理),作用48 h后,流式细胞术检测786-0细胞细胞周期的分布,RT-PCR法检测细胞中肝细胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM)基因mRNA的转录水平,Western blot法检测细胞中有丝分裂抑制缺陷蛋白1(mitotic arrest deficiency 1,MAD1)的表达水平;将腺病毒质粒hepaCAM及空腺病毒质粒瞬时转染786-0细胞,Western blot检测细胞中hepaCAM及MAD1蛋白的表达水平。结果 IFNγ可抑制786-0细胞的增殖,且呈时间-剂量依赖性(P0.05);与细胞对照组相比,试验组细胞G1期细胞比例、hepaCAM基因mRNA的转录水平及MAD1蛋白的表达水平均明显升高(P均0.01);转染腺病毒质粒的786-0细胞中hepaCAM和MAD1蛋白的表达水平明显高于空腺病毒质粒组及空白对照组(P0.05)。结论 IFNγ可能通过hepaCAM-MAD1途径使细胞周期阻滞于G1期,从而抑制肾癌786-0细胞增殖,本实验为进一步研究肾癌的发生发展机制及有效治疗途径奠定了基础。     

抗坏血酸与乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的相关性

目的 探讨抗坏血酸与乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的相关性。方法分别用0.5、1.0、2.0和4.0mmol/L的抗坏血酸处理MDA-MB-231细胞,MTT法检测细胞增殖水平;RT-PCR检测细胞p53和bcl-2基因mRNA的转录水平;West-ern blot检测细胞P53和bcl-2蛋白的表达;流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果不同浓度的抗坏血酸均可明显抑制MDA-MB-231细胞增殖,促进其凋亡,并使细胞p53基因mRNA转录水平及P53蛋白的表达水平明显升高,而bcl-2基因mRNA转录水平及bcl-2蛋白表达水平明显降低,且均呈剂量依赖性。结论抗坏血酸能抑制MDA-MB-231细胞增殖,诱导其凋亡,其机制可能是通过上调P53,下调bcl-2介导的。     

Kozak序列引导的人p53基因重组智能腺病毒载体的构建与表达

目的构建Kozak序列引导的人p53(khp53)基因重组智能腺病毒载体rAdMH-khp53,并检测p53基因的表达。方法将带有Kozak序列的p53基因克隆到重组腺病毒穿梭载体中,再利用AdMaxTMHi-IQ系统,获得重组腺病毒,检测病毒滴度,并进一步感染Saos-2细胞,利用RT-PCR及Western blot检测p53基因的表达。结果khp53基因成功克隆到腺病毒载体中,重组腺病毒滴度为1.63×108IU/ml,RT-PCR方法检测到p53基因的转录产物,Western blot检测到p53基因在Saos-2细胞中的高水平表达。结论已成功构建了带有Kozak序列的重组腺病毒载体rAdMH-khp53,并高效表达人p53基因。     

Msi2对急性髓系白血病THP-1细胞体外增殖能力的影响

目的观察Musashi(Msi)2对急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia,AML)THP-1细胞体外增殖能力的影响,初步探讨Msi2在AML中可能的调控作用。方法利用RNA干扰技术沉默Msi2表达,实时荧光定量PCR法检测Msi2、cyclin D1、p21、cdk2基因mRNA转录水平;Western blot法检测Msi2蛋白表达水平;生长曲线观察THP-1细胞体外增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期进程。结果与scramble组及空白对照组相比,Msi2-siRNA组细胞cyclin D1、cdk2基因mRNA转录水平明显降低(P0.05),p21基因mRNA转录水平明显增高(P0.05),Msi2 mRNA转录及蛋白表达水平均明显降低(P0.05);Msi2-siRNA组细胞体外增殖能力降低(P0.01);G1期细胞比例明显增高(P0.05),S期细胞比例显著降低(P0.05)。结论 Msi2可能通过调控细胞周期进程,促进白血病细胞恶性增殖,在AML的发生发展中发挥重要作用。     

c-ski基因重组腺病毒质粒的构建及其对肿瘤相关成纤维细胞增殖的影响

目的构建携带c-ski基因的重组腺病毒质粒,并检测其对肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)增殖活力的影响。方法以pcDNA3-c-ski质粒为模板,PCR扩增c-ski基因,与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-c-ski,经PmeⅠ线性化后,转化感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒,经PacⅠ线性化后,转染HEK-293细胞,获得重组腺病毒,经扩增及纯化后测定病毒滴度。将纯化的重组腺病毒感染乳腺癌CAFs,采用Western blot法检测感染细胞中c-Ski蛋白的表达水平;MTT法和细胞计数法检测重组腺病毒对CAFs细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切鉴定证明构建正确;转染HEK-293细胞48 h后可见大量绿色荧光蛋白的表达,纯化的重组腺病毒的滴度为3.11×1010IFU/ml;感染重组腺病毒的乳腺癌CAFs中c-Ski蛋白的表达水平明显高于空病毒组和空白对照组(P<0.001),且增殖活力明显高于空白对照组(P<0.05)。结论成功构建了表达c-ski基因的重组腺病毒质粒,其可明显促进CAFs的增殖,为进一步研究c-Ski对CAFs增殖分化等生物学功能的影响及作用机制提供了实验依据。     

乙型肝炎病毒X蛋白对小鼠胚胎肝干细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

目的研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X蛋白(HBx)对小鼠胚胎肝干细胞(embryonic liver stemcell,ELSC)凋亡及相关蛋白Bcl2、Mcl1、Bax表达的影响。方法采用表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的腺病毒载体系统将HBx基因转入小鼠胚胎肝干细胞ELSC14.5中,采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中HBx基因mRNA的转录和蛋白的表达;Hoechst33342染色法观察细胞核的改变;TUNEL法和流式细胞术检测细胞的凋亡情况;Real-time PCR和Western blot法检测抗凋亡因子Bcl2、Mcl1和促凋亡因子Bax基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果重组腺病毒Ad-GFP-HBx能有效感染ELSC14.5细胞,HBx基因和蛋白均能特异性表达;感染的ELSC14.5细胞核呈现固缩,且边缘化的细胞数减少,细胞凋亡率降低;细胞中Bcl2和Mcl1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均增高,而Bax的表达降低。结论 HBx可通过调节Bcl2家族中抗凋亡因子和促凋亡因子的比例失衡,来抑制小鼠胚胎肝干细胞的凋亡,促进其存活。     

腺病毒介导的slit2 shRNA对缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞中血管内皮生长因子表达的影响

目的观察腺病毒介导的slit2 shRNA对缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells,RPE)中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响,探讨slit2在脉络膜新生血管(chorodal neovascularation,CNV)中的可能作用,为CNV的治疗提供新的思路。方法分别采用RT-PCR和免疫组化法检测人视网膜色素上皮-19(ARPE-19)细胞中slit2及受体Robo1基因mRNA的转录和蛋白的表达;用200μmol/L氯化钴处理人ARPE-19细胞,建立化学缺氧模型,以未缺氧组作为对照,采用Real-time PCR和Western blot法检测在缺氧状态下细胞中slit2、Robo1、VEGF基因mRNA及蛋白水平表达的变化;将缺氧的人ARPE-19细胞随机分为shRNA处理组(加入Ad-slit2-shRNA)、空腺病毒组(加入空腺病毒)和缺氧组,24 h后收集各组细胞,Real-time PCR和Western blot法检测slit2 shRNA干扰后细胞中slit2、Robo1、VEGF基因mRNA和蛋白水平表达的变化,ELISA法检测细胞培养上清中VEGF蛋白水平的变化。结果在正常人ARPE-19细胞中有slit2和Robo1基因mRNA的转录及蛋白的表达;缺氧组人ARPE-19细胞中slit2、Robo1、VEGF基因mRNA和蛋白的表达水平均较未缺氧组明显升高(P0.05);与缺氧组相比,slit2-shRNA处理组人ARPE-19细胞中slit2、Robo1、VEGF基因mRNA和蛋白的表达水平均明显降低(P0.05),缺氧组与空腺病毒组slit2、Robo1、VEGF的变化差异无统计学意义(P0.05)。结论 slit2 shRNA沉默RPE细胞中的slit2后,可明显抑制缺氧诱导的RPE细胞中VEGF的表达,为临床CNV的治疗提供了新的思路。     

FOXC1蛋白基因shRNA干扰质粒对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

目的探讨FOXC1蛋白基因RNA干扰质粒对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法采用RT-PCR及Westernblot法检测SGC-7901细胞和胃黏膜上皮细胞GES-1中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。构建3个FOXC1基因shRNA真核表达质粒pshRNA-FOXC1a、pshRNA-FOXC1b、pshRNA-FOXC1c,分别转染SGC-7901细胞,并设pGenesil-1空质粒转染组和未转染的细胞对照组,RT-PCR及Western blot法分别检测转染细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;MTT法检测转染细胞的增殖活力;流式细胞术检测转染细胞的细胞周期。结果 SGC-7901细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均显著高于GES-1细胞(P<0.05)。pshRNA-FOXC1a组、pshRNA-FOXC1b组和pshRNA-FOXC1c组SGC-7901细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均显著低于pGenesil-1组和SGC-7901组(P<0.01);细胞增殖抑制率显著高于pGensil-1组(P<0.05)。处于G1、G2期的细胞比例显著高于SGC-7901组(P<0.01),S期细胞比例显著低于SGC-7901组(P<0.01)。结论成功构建了FOXC1蛋白基因shRNA真核表达质粒。FOXC1在胃癌细胞SGC-7901中呈高表达,抑制其表达后,细胞周期被阻滞在G1～G2期,细胞增殖受到抑制。     

NIRF蛋白对妊娠早期绒毛滋养细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制

目的观察NIRF蛋白对妊娠早期绒毛滋养细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法取正常妊娠妇女人工流产绒毛组织(8~10周),按常规分离方法获得滋养细胞,进行原代培养。通过上/下调NIRF在滋养细胞中的表达后,采用qRT-PCR法检测p53基因mRNA的转录水平;Western blot法检测p53蛋白的表达水平;MTT法检测滋养细胞的增殖能力;Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡情况。结果与未转染组比较,NIRF上/下调后,p53基因m RNA转录水平差异无统计学意义(P0.05);NIRF上调,p53蛋白表达水平明显下降(P0.05),早期绒毛滋养细胞增殖能力显著增强(P0.05),凋亡率差异无统计学意义(P0.05);NIRF下调,p53蛋白的表达水平明显升高(P0.05),早期绒毛滋养细胞增殖能力明显减弱(P0.05),凋亡率明显上升(P0.05)。结论 NIRF在蛋白水平上抑制了p53的表达,促进了滋养细胞的增殖。     

沉默血管内皮钙黏蛋白基因对人高转移肝癌HCCLM3细胞增殖及迁移的影响

目的探讨沉默血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)基因对人高转移肝癌HCCLM3细胞增殖及迁移的影响。方法将携带3种不同抑制靶点的VE-cadherin基因沉默重组质粒GV248-shRNA-VEcadherin(1)、(2)、(3)分别转染至人高转移肝癌HCCLM3细胞,同时设阴性对照组(转染空载体质粒GV248-shRNANC)和空白对照组(未转染)。采用qRT-PCR及Western blot法分别检测各组细胞中VE-cadherin基因mRNA转录及蛋白的表达水平,同时筛选出最有效的靶点。MTT法测定各组细胞的体外增殖能力;Transwell小室试验检测各组细胞的迁移能力。结果与空白对照组及阴性对照组比较,3组转染VE-cadherin-shRNA干扰质粒的HCCLM3细胞的VE-cadherin基因mRNA转录及蛋白表达水平显著降低(P0.05),其中GV248-shRNA-VE-cadherin(1)的VEcadherin基因抑制率最高(P0.05),筛选为最佳靶点;最佳靶点干扰组HCCLM3细胞的增殖及迁移能力均明显降低(P0.05)。结论沉默VE-cadherin基因可显著抑制人高转移肝癌HCCLM3细胞的增殖及迁移。