烟草黄瓜花叶病毒抗性位点发掘

烟草黄瓜花叶病毒（CMV）是烟草生产中主要病害之一,发掘其抗性位点,培育抗病品种是最有效的策略之一。本研究利用高抗CMV烤烟品种台烟8号为轮回亲本,优质感病烤烟品种NC82为供体亲本,配置BC1F1群体。在此基础上,利用组织快繁技术对200份BC1F1群体进行快繁,苗期人工接种CMV,获得稳定、可靠的表型数据。利用SSR标记构建遗传图谱,进而利用单向方差分析和完备复合区间作图法发掘CMV抗性位点。结果表明,单向方差分析法分别检测到5个与发病率性状和病情指数性状相关的标记;完备复合区间法共定位到5个QTL,其中2个与发病率性状相关,3个与病情指数性状相关。相关定位结果对开展分子育种辅助改良烟草CMV抗性具有一定意义。     

烟草种质资源对黄瓜花叶病毒抗性鉴定研究

进行了９２２份烟草种质资源ＣＭＶ的抗病性室内苗期鉴定,筛选出１６份高抗种质,１６５份中抗种质,４１６份中感种质,３２５份高感种质,未发现免疫种质。在３０份材料进行的对比鉴定中,室内鉴定结果和田间自然发病结果的病情指数相关系数ｒ＝０２６１３（置信度０．８２９０）,相关不显著,分析原因系由田间病毒种类复杂所致。并发现中抗材料铁把子和Ｔ１２４５,特别是铁把子在田间综合表现优异,可能对多种病毒具有广谱的抗性。作者就烟草对病毒病的抗性鉴定中抗性划分方法进行了讨论,认为相对抗性指数较好,并提出了一套标准对照品种,以供烟草种质资源研究参考。     

云南烟草中烟草花叶病毒株系比较与分析

利用TAS-ELISA方法对采自云南不同烟草种植区的710份花叶病样进行检测,其中546份样品与TMV抗体呈阳性反应。根据地理分布的差异,选择了38个代表性分离物进行TMV外壳蛋白基因的IC-RT-PCR扩增、克隆和测序。测序分析表明,38个TMV cp基因核苷酸序列相似性在95%~100%之间,其推导的氨基酸序列同源性为97.5%~100%。云南不同TMV分离物与TMV-U1、TMV-Fujian核苷酸相似性大于90%,其系统关系与TMV-U1和TMV-Fujian分离物聚为一簇,研究表明云南38个烟草分离物均属于TMV-U1株系。      

沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草

  目的  本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T₁代转基因抗CMV株系。  方法  构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）,以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85。  结果  抗性筛选获得112株T₀代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T₀代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T₀代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株。选取10个T₀代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T₁代抗病性,发现部分T₁代烟株发生一定比例的抗感分离,T₁代抗性株率为46.7%~100%。Real-time PCR检测T₁代烟株,发现T₁代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株。  结论  基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。      

不同处理对烟草种子萌发及过氧化氢酶活性的影响

以烤烟型品种NC89为材料 ,通过浸种处理研究了不同K+浓度、H+浓度、渗透势及H2 O2 等对烟草种子萌发过程中呼吸速率和过氧化氢酶活性的影响。 0 .0 1～ 0 .1mol/LKNO3处理对种子萌发过程中活力指数和过氧化氢酶活性有明显的促进作用 ;0 .0 0 1～ 0 .0 1mol/LHCl处理后其活力指数、第 4天的过氧化氢酶活性和呼吸速率都比对照高 ;2 0 0～ 30 0g/L的PEG - 6 0 0 0溶液浸种 2 4h ,对烟草种子活力的提高也有明显效果 ;0 .3%H2 O2 虽能提高烟草种子的呼吸速率 ,但其发芽势及活力指数均低于对照     

水体中烟草花叶病毒的浓缩与检测方法

为了检验水体中TMV的浓缩和检测方法的效果,在含和不含土壤颗粒的水中加入感染烟草花叶病毒(TobaccoMosaicVirus,TMV)病叶汁液,然后用低速离心法和带正电荷微孔滤膜吸附法浓缩,再用接种心叶烟、普通烟K326和间接酶联法检测浓缩物中TMV存在与否。含土壤颗粒的样品的离心法浓缩物用接种心叶烟检测,同一个稀释度离心浓缩比不处理对照的枯斑数明显要多。说明离心法有一定的浓缩效果。接种K326检测法、离心浓缩法、上清液和不处理(对照)的最低检出稀释度接近,说明离心浓缩方法的回收效果较差。用酶标板间接ELISA检测,离心处理的最低检出稀释度低于离心上清液和不处理对照。推测可能原因是土壤滤出液降低酶标板吸附TMV的效率。含和不含土壤颗粒的样品吸附法浓缩物用接种心叶烟检测,同一个稀释度吸附浓缩比不处理对照的枯斑数明显要多,吸附浓缩的最低检出稀释度比不处理对照高3个稀释度,说明吸附法有一定的浓缩效果。用接种K326检测,吸附浓缩的最低检出稀释度为1:2500倍(土壤滤出液+病叶汁液)和1:5000倍(自来水+病叶汁液)。吸附滤出液检不出TMV。用酶标板间接ELISA检测,吸附处理比吸附滤出液的最低检出稀释度高5~6个梯度、比不处理对照高4个稀释度,同样说明吸附法有较好的浓缩效果和回收效果。吸附法可用于水体病毒浓缩。      

烟草与TMV 非亲和性互作中根系活力及CAT活性变化

漂盘培育枯斑三生烟,苗期接种TMV后3、7、11、15、19、23、27、31 d 分别取样测定其根系的活力和过氧化氢酶活性,并以未接种TMV烟苗根系活力和过氧化氢酶活性为对照。结果表明,枯斑三生烟接种病毒后,其根系CAT活性值与取样时间有较强的负相关性(r= -0.9,p < 0.01)。根系活力最初迅速升高,之后又逐渐降低呈平稳趋势。     

烟草黄瓜花叶病毒一步法RT-PCR检测试剂盒的研制与初步应用

为快速准确地检测烟草黄瓜花叶病毒(CMV),根据黄瓜花叶病毒基因组序列相对保守区域设计了一对特异性引物,整合了反转录和PCR反应所需酶和缓冲液,通过反应条件的优化,建立了基于一步法RT-PCR检测烟叶感染CMV的方法,在此基础上组装了检测试剂盒.进一步分析了该试剂盒的特异性、稳定性和检测灵敏度.结果表明,该试剂盒具有很强的特异性、良好的重复性和较高的灵敏度(模板RNA浓度最低达到10 ng量级).初步应用结果显示,在多个烟区采集的病叶样品检测结果均与ELISA检测结果一致,能够成功检测出CMV.     

烟草黄瓜花叶病毒湖北分离物全基因组序列分析及亚组鉴定

为明确我国湖北烟区烟草黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的亚组类型,对湖北地区侵染烟草的CMV HB24株系进行基因组全长克隆和序列分析。结果表明,HB24株系RNA1(GenBank序列号:KC019299)全长为3363个核苷酸(nt),编码993个氨基酸的1a蛋白;RNA2(GenBank序列号:KC019300)全长为3049nt,编码859个氨基酸的2a蛋白和111个氨基酸的2b蛋白;RNA3(GenBank序列号:KC019301)全长为2216nt,编码279个氨基酸的3a蛋白和218个氨基酸的CP蛋白。核苷酸序列同源性分析表明,HB24与Fny,SD和Q株系RNA1同源性分别为91.6%,91.1%和75.9%,RNA2同源性分别为91.8%,97.8%和69.5%,RNA3同源性分别为92.1%,93.4%和73.2%;与同属花生矮化病毒(Peanut stunt virus,PSV)ER株系RNA1,RNA2和RNA3的同源性分别为65.5%,56.7%和54.1%,与同属番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)V株系同源性分别为66.9%,57.7%和51.5%。HB24 RNA3 5′NTR(Nontranslated region)的结构分析以及RNA3 5′NTR和CP基因核苷酸序列系统进化树的分析表明,HB24属于CMV亚组IB。     

几种药剂对烟草漂浮苗干根中烟草花叶病毒的失活效果

为了提出烟草漂浮育苗旧苗盘残留物中烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）的消毒方法,采用接种枯斑寄主和接种普通烟K326方法,测定了几种药剂对病苗干根中TMV的失活效果。结果表明,98％磷酸三钠25 g/L 和50 g/L溶液浸湿后塑料膜覆盖2～3 d 可彻底失活病苗干根中的TMV,40％育宝6.7 g/L溶液浸湿后塑料膜覆盖3～4 d对病苗干根中TMV失活效果高,推荐这两种药剂用于旧苗盘TMV消毒。下列消毒溶液处理对病苗干根中TMV不能完全失活:美国消毒剂20 g/L溶液浸湿后塑料膜覆盖5 d、2％二氧化氯10 g/L溶液、7%有效氯次氯酸钠10 g/L溶液、高锰酸钾3.3 g/L溶液和30%有效氯漂白粉50 g/L溶液浸湿后塑料膜覆盖7 d。上述药剂消毒旧苗盘TMV的浓度和处理方法需要进一步试验。抗病毒剂2%菌克毒克1.7 g/L溶液、3.95%病毒必克2.0 g/L溶液、24％毒消1.7 g/L溶液都不适宜于旧苗盘TMV浸泡法消毒。与药剂浸湿后塑料膜覆盖方法相比,药剂浸泡法的可操作性差。三抗体夹心法和TMV试纸条检测结果表明,上述药剂浸泡30～120 min和浸湿后塑料膜覆盖8 h～7 d后,不能有效破坏干病根样品中TMV抗原。      

病毒抑制剂防治烟草花叶病田间试验

为了筛选防效较好的病毒抑制剂 ,对目前市售的防治烟草花叶病 (TMV和CMV)的 8种主要化学药剂和 4种植物提取物进行了防治烟草花叶病的田间试验。试验结果表明 ,2 %“菌克毒克”AS和4 0 %“病毒灵”WP具有明显的预防效果 ;3.95 %“病毒必克”WP、4 0 %“病毒灵”WP、商陆 (Phytolaccaaci nosa)的乙醇提取物和香菇 (Lentinusedodes)的水提取物具有一定的治疗效果。     

病毒抑制剂对烟草普通花叶病防治效果试验

为了筛选防效较好的病毒抑制剂,于2002年在中国烟草东北农业试验站进行了5种病毒抑制剂防治烟草普通花叶病田间试验,采用YC/T40-1996烟草病害药效试验方法计算病情指数和防治效果。试验结果表明:3.95%"病毒必克"500倍液、22%"金叶宝"400倍液、24%"毒消"1000倍液、"净土灵"600倍液和"消毒立逃"800倍液防效分别为62.47%、57.83%、57.60%、46.42%和39.40%。     

几种防治烟草普通花叶病药剂的田间药效

为给防治烟草普通花叶病的药剂选择提供依据 ,进行了“毒消”6 0 0倍、“病毒必克”5 0 0倍 (药剂 )和氨基酸 30 0倍、“丰农”5 0 0倍 (叶面肥 )田间防效试验。结果表明 ,烟株发病初期开始施药 ,“毒消”6 0 0倍在首次施药后防效达 73.2 4 % ,第 3次施药后各药剂防效下降并在停止施药后 30d病情发生反弹 ;烟株发病中期开始施药 ,首次施药后“病毒必克”5 0 0倍防效达 75 .90 % ,此后各药剂防效均下降 ;氨基酸30 0倍和“丰农”5 0 0倍防效较差     

抑制烟草花叶病毒活性植物的筛选

本研究采用半叶枯斑法和烟草病害分级标准,对抗TMV的活性植物进行筛选,系统测定了艾蒿、板蓝根、柴胡等24种植物的粗提取物对烟草花叶病毒（TMV）的抑制效果,包括体外钝化TMV作用、抑制TMV初侵染;并采用盆栽法,研究植物粗提取物对烟草花叶病的保护和治疗作用等。试验表明,银杏、栀子、商陆、赤芍等植物粗提取物的综合防治效果较好,有进一步开发和利用的前景。     

烟草抗花叶病新品系“转墓因NC89”选育技术的研究

本文报导了国内首例抗烟草花叶病毒（ＴＭＶ）和黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）的转基因双抗烟草新品系的选育方法，获得了具有抗ＴＭＶ和ＣＭＶ的双抗优质新品系。在新品系第４—６代的田间试验中，验证了其抗病毒特性的遗传稳定性；与对照品种ＮＣ８９在农艺性状、品质和烘烤特性等方面进行比较，证明转基因抗病新品系除抗病性显著增强外，其它特性均略优于原ＮＣ８９良种。１９９２年在河南省示范推广６６６７ｈｍ~２，转基因抗病新品系对烟草花叶病的相对控制效果为５０％－７０％，防病增产的经济效益显著。     

烤烟漂浮育苗中普通花叶病的主要传播途径

对烤烟漂浮育苗过程中TMV传播途径进行了研究。结果表明:各种剪叶方式均能传播TMV,而且传播效率极高,剪叶是漂浮育苗中TMV引起的烟草普通花叶病在苗期传播的最主要、最有效的途径。而受TMV污染的漂浮盘、营养液和基质是TMV在漂浮育苗中传播的主要初侵染源,但对TMV的传播效率较低。     

一种利用水提物快速简便检测烟草中TMV 的方法

由烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)侵染所致的植物病毒病是世界性的难题,具有寄主广泛,易于传播等特点。笔者研究了一种快速简捷检测烟草中TMV 的方法,通过利用无菌水研磨TMV 侵染后发病的烟草病叶,取上清液进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测,可检测到一条特异性的,大小为6 000 bp 的电泳条带,而在健康烟草叶片水提物中却检测不到该电泳条带的存在。以TMV 复制酶基因片段为探针,对该特异性电泳条带进行Northern-blotting 分析。结果表明, 水提物中的电泳条带与TMV 复制酶基因探针发生较强的杂交信号,暗示该条带可能为TMV 的基因组。因此,该方法可在 10 min 内方便快速的检测烟株中TMV 的存在,避免了常规血清学检测和分子检测(RT-PCR 和western-blot)等方法的昂贵试剂和繁琐的操作步骤。但是该方法的水提取物在室温下不稳定,当静止3 h 以上,就很难再检测到特异性的电泳条带。     

基于烟草花叶病毒模板高密度纳米金的制备及其对卷烟烟气CO的影响

通过将SO32-,SCN-引入体系来提高纳米金在烟草花叶病毒(TMV)模板上的生长密度,同时将制得的TMV-纳米金复合材料以悬浮液的形式加入肯塔基参比卷烟的滤嘴中,对样品卷烟进行CO释放量的检测,并用透射电镜、紫外-可见吸收光谱、热重仪对TMV-纳米金复合材料进行分析表征。结果表明:①在添加量为0.7 mL/支的情况下,卷烟烟气CO释放量的降低率为27.43%,CO的选择性降低率为16.33%。②本方法可对纳米金进行有效的粒径控制和更为高效的负载,这也是TMV-纳米金复合材料提高卷烟烟气中CO催化氧化性能的原因所在。TMV-纳米金复合材料加入卷烟滤嘴中,可以有效地选择性降低烟气中的有害成分。