α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

α-淀粉酶基因经改造后,克隆到穿梭质粒pBE2中。在α-淀粉酶基因的上游连接枯草芽孢杆菌sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR),构建了含突变α-淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体pBSAT,转化蛋白酶三缺陷枯草芽孢杆菌菌株DB403。含有pBSAT的菌株可将突变α-淀粉酶分泌到胞外,表明sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR)能很好的将枯草芽孢杆菌中的重组α-淀粉酶引导到胞外,完成分泌表达。分泌的α-淀粉酶具有较高的耐酸性及生物学活性。     

极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

为探索极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis WB600）中的高效分泌表达条件,对来源于枯草芽孢杆菌的9?种Sec分泌途径信号肽进行筛选,结果显示信号肽YfkN的引导分泌效率最高。在此基础上,为进一步优化PFA的分泌表达,对信号肽YfkN的Ile3和Gln4进行饱和突变,并比较不同突变体的引导分泌效率。结果表明突变体I3G/Q4R的引导分泌效率最高,重组枯草芽孢杆菌的胞外α-淀粉酶活力高达715?U/mL。重组α-淀粉酶PFA的最适反应pH值为5.0,最适反应温度为100?℃,于100?℃的半衰期长达13?h,并且不依赖于Ca2＋。结果表明,采用信号肽I3G/Q4R,极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA能够在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达,这有利于其在淀粉液化工艺中的应用。     

芽孢杆菌的产酶特性及其对抗生素的耐受性

以4株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和2株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）为研究对象,通过测定其成胞率、中性蛋白酶活性及对24种抗生素的耐受性,从中筛选优良芽孢杆菌。结果表明,从6株芽孢杆菌中筛选得到3株成胞率和产中性蛋白酶均较好的芽孢杆菌,分别为枯草芽孢杆菌BLCC1-0552、BLCC1-0615和地衣芽孢杆菌BLCC1-0441,液体发酵24 h后,成胞率较高,均达到98%;中性蛋白酶活性分别为90.58 U/mL、100.32 U/mL和24.72 U/mL。其中,枯草芽孢杆菌BLCC1-0615固体发酵玉米-豆粕型常规饲料产中性蛋白酶活力最高,发酵48 h时达到2 154.49 U/g。3株芽孢杆菌对抗生素的耐受性不一致,其中枯草芽孢杆菌BLCC1-0615对24种抗生素中的17种表现敏感,敏感率最高为70.83%。因此,确定优良菌株为枯草芽孢杆菌BLCC1-0615,其成胞率、产中性蛋白酶能力好及对抗生素耐受性较低,具有作为饲料添加剂应用于畜禽饲料中的潜力。     

原桃胶中1株芽孢杆菌的分离鉴定及其主要抗菌物质

从天然原桃胶分离到1 株产抑菌活性物质的芽孢杆菌TJ12。其发酵产物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）有抑菌活性。结合菌落形态、生理生化指标、16S rRNA序列和gyrB序列将TJ12菌株鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。通过硫铵沉淀、有机溶剂萃取、羟丙基葡聚糖凝胶、高效液相色谱分离纯化,得到其主要活性物质。该物质对pH值、温度和3 种蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶）有较好的稳定性。经电喷雾电离质谱分析,初步鉴定该株地衣芽孢杆菌TJ12的主要抗菌物质为杆菌肽A。     

沉香型酒醅中产香芽孢杆菌的分离鉴定及代谢产物分析

从沉香型酒醅中分离产香芽孢杆菌并进行发酵风味分析。通过平板分离得到4株产香较好的芽孢杆菌,并进行16S rDNA序列分析和构建系统发育树,4株菌分别为阿式芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniform）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。其中地衣芽孢杆菌产蛋白酶和淀粉酶能力均为最强且最适生长温度为50 ℃。以玉米粉为底物进行单菌液态发酵,采用固相萃取和气相色谱-质谱法(SPME-GC-MS)分析发酵液中的风味物质,一共检测到24种风味物质,其优势产物主要为3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇和一些酸类等风味物质。由此而见,阿式芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌这4类菌对沉香型白酒风味的形成均具有重要作用。     

信号肽编码序列库的构建及耐热乳糖酶的分泌

为了实现来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,建立一种较简便的方法筛选能够分泌该酶的信号肽,即针对11种信号肤构建信号肽编码序列库,采用随机筛选方法得到合适的信号肽,构建相应的分泌表达载体和重组表达菌株.结果表明,通过信号肽随机筛选方法获得的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶NprE信号肽能够有效引导该酶的细胞外分泌,重组菌株摇瓶培养16h后,上清液中积累的耐热β-半乳糖苷酶活力达到64.02 U/mL,占该酶所表达的总酶活力的29.6％.该信号肽筛选方法可以为微生物蛋白质分泌过程中的信号肽快速选择和优化提供参考.     

XJT-9503高温中性蛋白酶基因Gp1的克隆、表达及序列分析

试验根据地衣芽孢杆菌XJT9503的高温中性蛋白酶酶蛋白所测定的N-端及部分肽段氨基酸序列及质谱分析结果设计了PCR引物,用PCR方法从地衣芽孢杆菌XJT9503中扩增了高温中性蛋白酶基因Gp1,对所获得的基因进行序列分析测定,并与蛋白酶的氨基酸序列分析对比。GP1基因全序列共1129bp,包括整个阅读框,共编码376个氨基酸。将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pET-28a中,构建成重组分泌型表达载体pGp1。并在大肠杆菌宿主BL21中得到表达。SDS-PAGE分析显示产物的分子量为27.0×103,同核酸序列测定所推导的值相符。同时,对地衣芽孢杆菌XJT9503中性蛋白酶基因序列进行了测定和比较分析,发现与地衣芽孢杆菌6816丝氨酸蛋白酶和地衣芽孢杆菌1411T角蛋白水解酶基因的同源性为97%。     

Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中分泌途径的鉴定及其分泌能力的提高

食品安全（GRAS）菌株枯草芽孢杆菌由于其具有良好的分泌表达能力及易于基因工程操作等特性被广泛用作外源蛋白质的表达菌株。枯草芽孢杆菌中蛋白质的分泌大多依赖于信号肽介导的Sec分泌途径（General secretion pathway）和Tat分泌途径（Twin-arginine translocation pathway）。在本研究中,通过信号肽预测、蛋白质N端测序等手段发现来自于Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌并不依赖信号肽,该酶通过非经典蛋白质分泌途径（non-classical protein secretion pathway）进行分泌。通过信号肽筛选,发现最适合该酶在枯草芽孢杆菌中表达的信号肽为Tat分泌途径信号肽SP_phoD,并通过共表达分子伴侣PrsA的方式将该L-天冬酰胺酶的分泌量提高了72.11%。     

高产蛋白酶菌株的分离、鉴定及酶学性质研究

该研究旨在从非传统环境（磷矿）中分离、筛选高产胞外蛋白酶菌株，对菌株进行形态学观察、生理生化和分子生物学鉴定，并研究其蛋白酶的酶学性质。结果表明，分离筛选到一株蛋白酶高产菌株，编号为PB5，该菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），该菌株产胞外蛋白酶活力为562.3 U/mL，胞外蛋白酶的最适pH值为10，在pH 7～10有较好的pH稳定性；最适温度为60 ℃，20～50 ℃时有较好的稳定性；Na+、Mg2+、Mn2+、K+对蛋白酶活力有明显的促进作用；Fe2+、Ag+、乙二胺四乙酸（EDTA）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、十二烷基硫酸钠（SDS）对蛋白酶活力有明显抑制效果。     

酒醅中芽孢杆属细菌的16S rDNA全序列系统学分析

从浓香型白酒窖池酒醅中分离到69株芽孢杆菌,通过形态特征和生理特性检测等传统鉴定方法,将其归为5个类群。用聚合酶链反应（PCR）扩增出5个类群代表菌株的16SrDNA基因全序列,并对其进行测序。用blast软件在Genbank中进行所得序列的同源性检索,并构建系统发育树。从系统发育树可以看出,样品中芽孢杆菌以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）为主,枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）也占有相当的比例,还有一定数量的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereuso表明窖池酒醅中芽孢杆菌呈现多样性,且优势种群不明显。     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。     

固态发酵生产菜籽肽菌种的筛选

以黑曲霉、白地霉、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉、产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、米曲霉和枯草芽孢杆菌为出发菌,菜籽粕为原料,氮溶解指数、氨基酸态氮、肽得率和蛋白酶活力为评价指标,对固态发酵生产菜籽肽的菌种进行研究结果表明:宇佐美曲霉、雅致放射毛霉和枯草芽孢杆菌发酵效果较好,发酵后产生了较多的低分子量菜籽肽,而枯草芽孢杆菌更适合单菌固态发酵生产菜籽蛋白肽。     

Extracellular secretion in Bacillus subtilis of a cytoplasmic thermostable β-galactosidase from Geobacillus stearothermophilus

β-Galactosidase catalyzes the hydrolysis of β-galactosides into monosaccharides and is widely used in dairy processing. This study reports the extracellular secretion of a cytoplasmic thermostable β-galactosidase from Geobacillus stearothermophilus IAM11001 in Bacillus subtilis. This enzyme has potential applications in the dairy industry. It was not secreted in B. subtilis by mediation of 3 general secretory signal peptides, but was secreted extracellularly when it was fused to a twin-arginine signal peptide of B. subtilis phosphodiesterase. Defined and rich culture media were used for recombinant enzyme production, and the extracellular target enzymatic activity reached about 44% of the total enzymatic activity synthesized at 18 h of cultivation in Luria-Bertani medium. As a control of secretion, when the signal peptide coding sequence was absent from the N terminus of the target gene bgaB, the extracellular target enzymatic activity obtained under the same condition of cultivation accounted for less than 7% of the total enzymatic activity synthesized. Results also showed that coexpression of the B. subtilis proteins TatAd and TatCd was indispensable for the secretion of the target enzyme.     

嗜热酸性普鲁兰水解酶Ⅲ的高效分泌表达及其酶学性质

本文探索了嗜热酸性普鲁兰水解酶Ⅲ Tk-PUL在枯草芽孢杆菌表达系统中的高效分泌表达条件,并对重组Tk-PUL的酶学性质进行了初步研究。通过构建Tk-PUL分泌表达信号肽筛选库,并结合高通量筛选方法,确定引导Tk-PUL在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达的信号肽。结果表明,在信号肽AmyE的引导下,重组Tk-PUL在枯草芽孢杆菌表达系统中高效分泌表达。Tk-PUL属于单结构域双功能酶,同时具有α-淀粉酶活性和普鲁兰酶活性。重组Tk-PUL的α-淀粉酶活性的最适反应pH为4.5,最适反应温度为100℃,对应的绝对酶活为54.08 U/mg,于100℃的半衰期约为2 h。重组Tk-PUL的普鲁兰酶活性的最适反应pH为4.5,最适反应温度为100℃,对应的绝对酶活为110.39 U/mg,于100℃的半衰期约为2 h。本研究为Tk-PUL在淀粉酶法制糖工业中的应用奠定了基础。     

液态发酵法制备菜籽ACE抑制肽菌种的筛选

采用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、白地霉、产朊假丝酵母、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉对菜籽粕进行液态发酵,以氮溶解指数、SN-TCA、氨基酸态氮、肽得率和ACE 抑制活性为评价指标,对液态发酵生产菜籽ACE 抑制肽的菌种进行筛选。结果表明：在上述菌种中枯草芽孢杆菌液态发酵所得肽得率最高,并且具有最高的ACE 抑制活性,菌种优势明显,是液态发酵菜籽粕生产ACE 抑制肽的优势菌种。     

胰凝乳蛋白酶SplB在枯草芽孢杆菌中的重组表达及应用

通过启动子优化、宿主筛选,构建了C端带His-tag的胰凝乳蛋白酶类蛋白酶SplB表达载体,成功实现了SplB在枯草芽孢杆菌中的重组表达,对纯化的重组SplB进行酶学性质研究,并实现了重组蛋白酶SplB在重组蛋白Prx标签切割中的应用。结果表明,以枯草芽孢杆菌ATCC6051Δ10为宿主,通过启动子P₄₃介导的重组蛋白酶SplB表达活力最高(10.24 U/mL)。通过亲和层析纯化了重组表达的SplB,并进行酶学性质研究,其最适温度为40℃,最适pH值为8.5,且具有良好的温度和pH值稳定性。在离子浓度较低情况下,Co²⁺对重组SplB活力有促进作用,Mg²⁺、K⁺不影响酶活力;而Cu²⁺、Zn²⁺、Ni⁺离子抑制SplB活力;十二烷基硫酸钠极大抑制重组SplB活力。将重组SplB应用于切割重组蛋白Prx的标签,结果表明,重组SplB具有WELQ肽段标签切割作用,并且SplB浓度越高,目标条带越浓。本研究为优化SplB的重组表达及在食...