一株海藻糖产生菌T007酶学特性的研究

对自行从土壤中筛选分离出的一株能合成海糖藻的菌株T007的酶学特性进行了研究。该酶最适反应温度为38～40℃，最适反应pH为pH6．6～7．2，Mg^2＋、K^＋对该酶有一定的激活作用，Ca^2＋、Ba^2＋、Mn^2＋对该酶有抑制作用，而Zn^2＋、Cu^2＋、Hg^2＋则可强烈地抑制该酶活力。试验证实，该菌株是在海藻糖合酶（trehalose svnthase）作用下特异性地以麦芽糖为底物转化为海藻糖的。该细胞酶在4℃保存14d酶活力仍保持稳定，-18℃保存期可延长到30d。     

产海藻糖合酶菌株筛选的研究

通过高温、高渗等手段从土壤中筛选到l株产海藻糖合酶（trehalosesynthase）滑性较高的菌株T007，其生长湍度15℃-41℃、pH3．0～9．0，并能往〈7％的NaCl盐性培养基中生长。实验证实，T007菌广生的海藻糖合酶能以麦芽糖为底物合成海藻糖。     

产海藻糖合酶菌株发酵培养基的研究

在已筛选出产海藻糖合酶菌株———恶臭假单胞杆菌的基础上 ,研究了该菌株最佳发酵培养基。恶臭假单胞杆菌H76的最适碳源为麦芽糖和葡萄糖 ,最适氮源为蛋白胨和酵母粉 ,无机盐为MgSO4 ·7H2 O ;该菌株产酶最佳培养基配方为 :麦芽糖 3 % ,葡萄糖 3 % ,Mg SO4 7H2 O 0 2 % ,蛋白胨 2 % ,酵母粉 0 7%。     

响应面法优化大肠杆菌产海藻糖合酶发酵培养基

以海藻糖合酶基因工程菌E.coli BL21（p ET15b-Tre S）为研究对象,以海藻糖合酶的酶活为考察指标,对海藻糖合酶基因工程菌E.coli BL21（p ET15b-Tre S）的培养基进行优化。首先运用单因素实验对大肠杆菌（E.Coli）产海藻糖合酶进行了优化,利用Plackett-Burman进行两因素两水平设计对影响其产酶因素进行评估并筛选出具显著效应的3种因素:葡萄糖、酵母浸粉和K2HPO4。用最陡爬坡实验逼近以上三种因素的最大响应面区域后,采用Box-Behnken进行三因素三水平的设计以及响应面分析,获得最佳产海藻糖合酶的培养基。结果表明,发酵大肠杆菌的最佳培养基配方为:葡萄糖7.2g/L,酵母浸粉6.6g/L,蛋白胨10g/L,（NH4）2SO45g/L,K2HPO415.7g/L,KH2PO44g/L,Mg SO4·7H2O1.6g/L,微量元素混合液0.5m L/L。在此条件下进行产酶重复实验5次,海藻糖合酶酶活为65U/mg,比优化前提高了91.2%。      

一株产海藻糖合成酶嗜中温芽孢杆菌的鉴定及其酶学性质

由长白山温泉附近土壤中筛选得到产海藻糖舍酶菌株，为革兰氏阳性菌，具有芽孢和鞭毛，其最适生长温度为55℃，对这一菌株进行生理生化指标测定。进一步对该菌株所产海藻糖合酶的酶学性质进行研究，酶反应最适作用pH值为7．0，在pH6．6～7．4时该酶稳定，最适作用温度为35℃，在25-45℃时该酶可稳定保存。     

高产酯化酶红曲菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

该研究从研究室保藏的10株红曲霉菌株中筛选高产酯化酶菌株,通过分子生物学技术对其进行鉴定,并对其最适培养基进 行选择,最后对其所产的酯化酶酶学特性进行初步研究。结果表明,筛选获得一株高产酯化酶菌株X1,并被鉴定为血红红曲霉（Monascus sanguineus）。 其最适产酶培养基为可溶性淀粉70g/L,大豆蛋白胨20g/L,NaNO3 2 g/L,KH2PO4 1 g/L,MgSO4·7H2O 2g/L, 初始pH值4.5。采用最优培养基,在30℃、180 r/min条件下发酵4d,酯化酶活力为315.19 U/mL。 该酯化酶的最适反应温度为40℃,在 25～35℃范围内稳定性较好;最适pH值为5.0,在pH为6.0时稳定性较高;金属离子Ca2+可提高该酯化酶活性,Mg2+、Fe2+、Na+和Ag+则有 不同程度抑制作用,且Ag+抑制作用最明显。     

产海藻糖合酶嗜热菌的筛选

采用薄层层析及高效液相色谱对酶反应产物进行分析的方法,从地热水样中筛选出一株产胞内海藻糖合酶的嗜热菌CBS-01菌株。该菌株在固体培养基中细胞为杆状,在液体培养基中细胞通常为丝状,丝状体长度可变,好氧,革兰氏染色阴性,无芽孢,菌落呈圆形,表面光滑,凸起,边缘整齐,暗红色,生长温度范围为40～70℃,最适生长温度为55～60℃,生长pH范围为6.5～9.5,最适生长pH值为7.5～8.5,初步鉴定为亚栖热菌(Meiothermus sp.)。     

一株海藻糖合成酶产生菌的筛选及初步鉴定

由长白山温泉附近土壤筛选得到菌株编号SH-110菌,分别利用TLC方法、HPLC法来确定该菌株所产的胞内酶能够利用麦芽糖作为底物来合成海藻糖,确定该酶为海藻糖合成酶,通过对该菌生物学特征鉴定,生理生化特征分析,初步鉴定该菌属于芽孢杆菌属(Bacillussp)。     

产海藻糖合酶菌株的筛选及发酵条件的优化

从土壤中分离筛选得到一株能合成海藻糖的菌株,经生物转化途径验证,该菌株含有特异性地将麦芽糖转化为海藻糖的海藻糖合酶,以海藻糖转化率为评价指标,对其进行摇瓶发酵条件的优化。结果表明,其发酵最适条件为：碳源为2%麦芽糖,氮源为0.5%酵母粉和1%蛋白胨,发酵初始pH值为7.0,接种量4%,发酵温度35 ℃,发酵时间48 h,在此优化条件下,海藻糖的转化率为50%。     

昆明假单胞菌HL22-2海藻糖合酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

采用热不对称交错聚合酶链式反应（Tail-PCR）克隆云南磷矿来源昆明假单胞菌（Pseudomonas kunmingensis）HL22-2的海藻糖合酶（TreS）基因HL22-2TreS,将该基因与表达载体pETM3C连接后在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）pLysS中进行异源表达,通过Ni-NTA柱纯化重组酶HL22-2TreS,并对其酶学特性进行分析。结果表明,HL22-2TreS基因全长3 336 bp,编码1 111个氨基酸,氨基酸序列与Genbank数据库中相关的海藻糖合酶具有极高的相似性。重组酶HL22-2TreS的分子质量约126 kDa,该酶的最适反应温度和pH值分别为40 ℃和7.0,在温度20～50 ℃及pH值6.0～9.0条件下比较稳定,Cu2+、Hg2+、Ba2+及Al3+对海藻糖合酶的活力有强烈的抑制效果。HL22-2TreS基因对麦芽糖和海藻糖的米氏常数（Km）分别为20.6 mmol/L和87.5 mmol/L,对麦芽糖具有更高的亲和性,更容易将麦芽糖转化成海藻糖。     

重组海藻糖合酶工程菌高密度发酵条件的研究

目的:通过对前期构建的海藻糖合酶基因工程菌进行高密度发酵的研究,获得了其高密度工艺条件。方法:采用摇瓶发酵和10L自控罐高密度发酵研究了培养基、pH、发酵方式对工程菌生长及目的蛋白表达的影响,并考察了工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果:海藻糖合酶基因工程菌高密度发酵的培养基为2YT+0.2%葡萄糖,最适pH为7.0,发酵方式为分批补料,通过10L自控罐高密度发酵最终得到的工程菌细胞密度达到了50.78g/L,酶活达到了3.197U/mL。所构建的重组质粒在宿主中得到了稳定遗传。结论:优化了海藻糖合酶基因工程菌高密度发酵的条件,为海藻糖规模化生产奠定了基础。      

海藻糖合成酶基因工程菌玉米浆培养基配方优化

以玉米浆作为重组大肠杆菌培养基的主要碳源和氮源,在单因素优化的基础上,选择玉米浆、MgSO4和微量元素3个因素对玉米浆培养基进行响应面设计,采用BoxBehnken试验设计和响应面分析法,确定基因工程菌最佳的玉米浆培养基配方。结果表明,最佳的玉米浆培养基配方为:玉米浆26g/L,MgSO42.1g/L,微量元素7mL/L。该条件下,重组大肠杆菌产海藻糖合成酶酶活达到120.5U/mL。试验证明了玉米浆作为重组大肠杆菌培养基唯一的碳源和氮源生产海藻糖合成酶的可行性。     

麦芽糖生物合成海藻糖的途径及合成条件的研究

由土壤分离出一株能合成海藻糖的菌株T007,经验证含有特异性地将麦芽糖转化为海藻糖的酶系。对麦芽糖浓度、反应时间、反应温度和反应转速等因素对麦芽糖转化率的影响进行了研究。结果表明,麦芽糖浓度对转化率影响很微弱;反应初期,温度越高,生成海藻糖的初始速度越快,但是到反应末期,反应速度减弱得也越快,转化率反而不是很高;反应转速对麦芽糖转化海藻糖有较大影响,反应的最佳转速为200r/min。     

壳聚糖固定化海藻糖合酶

利用壳聚糖作为载体,将大肠杆菌BL21异源表达且纯化后的海藻糖合酶(TreS),采用吸附法制备成固定化酶。固定化单因素实验结果表明,最适海藻糖合酶与壳聚糖的加入量为32.0 mg/g,最适吸附时间为2.5 h。固定化酶最适反应温度为40 ℃,最适反应pH为6.0,酶活回收率为40.17%,重复使用9次后,固定化酶酶活残留率为64.64%,重复使用性良好。在4~60 ℃范围内放置20 min后,固定化酶的相对酶活均高于87%,与游离酶相比温度稳定性没有明显变化。在pH3.5~8.5范围内放置20 min后,固定化酶的相对酶活均高于60%,酸碱稳定性优于游离酶。反应进程试验结果表明,2 h时海藻糖得率达最大,为61.4%。