巴斯德毕赤酵母外源蛋白表达研究

经过近二十年的不断发展,巴斯德毕赤酵母表达系统目前已经被广泛的应用于外源基因的表达,并且获得巨大的成功。与其他表达系统相比而言,巴斯德毕赤酵母表达系统对营养物质要求低、基因组结构简单、可进行高密度发酵,这些优点在很大程度上促进外源基因的表达。但是,巴斯德毕赤酵母在外源蛋白表达过程中也存在许多问题,例如只能以甲醇作为唯一碳源、产热量高等,这些因素在一定程度上限制该表达系统的进一步应用。我们对巴斯德毕赤酵母表达系统进行系统的研究与分析,以期为提高外源基因在其中的表达量提供一定的借鉴。     

毕赤酵母高效表达外源蛋白的分子水平策略

毕赤酵母表达系统具有许多优异特性,并且是目前最成功的外源蛋白表达系统之一。通过近几十年的快速发展,该系统已引起各界的广泛关注,并产生了巨大的经济和社会价值。与其他现有表达系统相比,毕赤酵母在目的蛋白翻译后修饰上有着极大优势,已被广泛应用于表达外源蛋白。但是另一方面,由于该系统受包括外源基因的特性、菌种、表达环境和发酵技术等多种因素的影响,,其在不同外源蛋白的表达上也表现出很大差异。该文着眼于分子水平上的基因转录、蛋白质加工、蛋白质降解以及转运分泌4个模块,介绍了利用毕赤酵母表达系统通过优化密码子、高拷贝数外源基因、引导肽筛选、敲除蛋白酶基因、共表达促折叠因子等途径提高外源蛋白表达效率的相关策略,并简要展望了该系统的发展前景,以期为构建高效毕赤酵母细胞工厂提供指导。     

低温诱导对毕赤酵母表达重组外源蛋白的影响

毕赤酵母表达系统是近年发展较为突出的表达系统之一.大量研究表明,低温诱导在毕赤酵母发酵过程中对促进细胞物质及能量代谢,提高胞内醇氧化酶活力及能量水平,降低细胞死亡率及蛋白酶作用有明显影响;此外,外源蛋白表达过程中的聚集与降解作用也与诱导温度有关.该文从诱导温度角度对重组毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展进行了综述.     

重组毕赤酵母生产外源蛋白的过程控制与生理分析的研究进展

毕赤酵母是近年来应用广泛、极受青睐的一种外源蛋白表达系统。除了构建高效、稳定的毕赤酵母生产菌株外,研究不同发酵控制条件下,细胞的生理和代谢状态变化,为毕赤酵母细胞提供最优的生长和环境条件并综合考虑发酵成本是成功实现外源蛋白规模化、商业化生产的保障。本文从培养基组分、外界环境条件、细胞比生长速率、生长期甘油流加策略和诱导期甲醇流加策略等方面阐述了发酵过程对外源蛋白表达的影响,并进一步从细胞生理和代谢层面深入讨论了不同发酵过程控制条件的影响机制。     

源于 GAP 启动子的毕赤酵母组成型表达系统的研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用非常广泛的外源基因真核表达系统。与源于醇氧化酶启动子(pAOX1)的诱导型表达系统相比, 源于三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)的毕赤酵母组成型表达系统在表达外源蛋白时不需使用甲醇, 表达时间短, 并且在高密度发酵时采用连续发酵模式, 因此成为近年研究的热点。本文分别从pGAP表达载体的构建、碳源、基因拷贝数、信号序列、高密度发酵等方面对该表达系统进行了综述, 以期为其在蛋白生产中的深入研究和应用提供参考。     

巴斯德毕赤酵母GS115基因组研究进展

毕赤酵母生物表达系统已成功地表达了多种重组外源活性蛋白,广泛地被应用于能源、医疗、科学研究等方面的研究.综述了2008年以来毕赤酵母GS115基因组研究,以期从分子水平解释转录调控、表达调控及翻译后修饰等机理,进而解决毕赤酵母发酵过程中产量低、过糖基化等瓶颈.     

源于GAP启动子的毕赤酵母组成型表达系统的研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用非常广泛的外源基因真核表达系统。与源于醇氧化酶启动子(pAOX1)的诱导型表达系统相比,源于三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)的毕赤酵母组成型表达系统在表达外源蛋白时不需使用甲醇,表达时间短,并且在高密度发酵时采用连续发酵模式,因此成为近年研究的热点。本文分别从pGAP表达载体的构建、碳源、基因拷贝数、信号序列、高密度发酵等方面对该表达系统进行了综述,以期为其在蛋白生产中的深入研究和应用提供参考。     

基于文献的毕赤酵母研究趋势分析

毕赤酵母作为一种表达外源蛋白以及积累代谢中间物的细胞工厂已经得到广泛应用。文献检索是分析毕赤酵母研究的重要手段。该文基于Web of Science数据库分析了毕赤酵母的文献数量变化、来源国家分布等,以阐明我国有关毕赤酵母的研究状况。同时,展望了毕赤酵母外源基因表达技术、发酵策略、过氧化物酶体吞噬等新研究动向。     

共表达透明颤菌血红蛋白提高脂肪酶在毕赤酵母中的表达

为了克服巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中的溶氧限制,提高外源蛋白的表达量,本文以启动子YPT介导透明颤菌血红蛋白(VHb)在培养过程中组成型表达。同时以启动子AOX1介导的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因作为报告基因,使CALB在甲醇诱导阶段表达。另外,还将绿色荧光蛋白在过氧化物表面表达,将红色荧光蛋白在过氧化物基质中表达以检测信号肽能否定位在相应的位置。最后,将VHb分别在过氧化物酶体表面和基质两个位置表达,以观察表达位置的不同所产生的影响。通过SDS-PAGE和Western Blot分析表明,CALB和VHb在重组菌中成功实现了共表达。在限氧条件下,重组菌株GS115/ExVHb、GS115/VHbSKL的外源蛋白CALB的表达量比对照菌株GS115/CALB分别提高了27.57%和20.52%。这说明VHb与外源基因共表达可以改善酵母在发酵过程中的摄氧情况,提高外源蛋白的表达量。     

外源脂肪酶在毕氏酵母表面展示及发酵过程分析

分别考察基于絮凝素和凝集素2种不同展示系统,展示有外源脂肪酶CALB(Candidan Antarctica lipase B)的重组展示酵母的展示酶活、上清酶活,发现毕赤酵母作为宿主在外源脂肪酶展示过程会分泌目的蛋白至上清中,引起"外泄",进一步通过重组展示酵母外源蛋白鉴定、外源蛋白去糖基化、发酵过程中蛋白变化趋势观察,表明基于絮凝素系统的非共价锚定是引起展示过程中蛋白外泄比例过高的主要原因,研究为实现脂肪酶在毕赤酵母细胞的高效展示进而提高展示酶的催化效率提供了理论指导。     

Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system

The Pichia pastoris expression system is being used successfully for the production of various recombinant heterologous proteins. Recent developments with respect to the Pichia expression system have had an impact on not only the expression levels that can be achieved, but also the bioactivity of various heterologous proteins. We review here some of these recent developments, as well as strategies for reducing proteolytic degradation of the expressed recombinant protein at cultivation, cellular and protein levels. The problems associated with post-translational modifications performed on recombinant proteins by P. pastoris are discussed, including the effects on bioactivity and function of these proteins, and some engineering strategies for minimizing unwanted glycosylations. We pay particular attention to the importance of optimizing the physicochemical environment for efficient and maximal recombinant protein production in bioreactors and the role of process control in optimizing protein production is reviewed. Finally, future aspects of the use of the P. pastoris expression system are discussed with regard to the production of complex membrane proteins, such as G protein-coupled receptors, and the industrial and clinical importance of these proteins.     

蛹虫草中谷氨酰胺转氨酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

谷氨酰胺转氨酶(TGase或TG)是一种可催化蛋白质间形成异肽键,使蛋白质改性的天然酶制剂。本文以蛹虫草基因组为模板,通过PCR扩增得到TGase相似蛋白的基因片段tgM,将其与大肠杆菌-毕赤酵母穿梭表达载体pPIC9K连接,构建重组表达载体pPIC9K-TG,在毕赤酵母中进行表达,实现目的蛋白的胞外分泌表达,结果发酵液中重组TGase的酶活力为100 U/L。本研究为TGase的异源表达及潜在的工业应用提供参考。     

基于自联想神经网络的毕赤酵母发酵过程两阶段故障诊断

在毕赤酵母表达人血清白蛋白-人白介素-2融合蛋白(IL-2-HSA)过程中,诱导期甲醇浓度和pH值直接影响了IL-2-HSA表达量的高低和发酵过程的稳定。为了准确有效的控制这两个参数,本论文基于毕赤酵母诱导期的生理学特性和过程参数特征,提出了基于自联想神经网络的毕赤酵母表达IL-2-HSA过程的诱导期两阶段故障诊断。研究结果表明该诊断系统能够在线快速准确地诊断出毕赤酵母诱导期的各种故障。当系统提示出现故障时,离线分析,对比最优的pH值和甲醇质量浓度变化曲线,确定故障类型,采取相应措施。     

不同发酵条件对重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂表达量的影响

将已在毕赤酵母中成功表达的重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂为研究对象,通过改变发酵培养时间、培养基装填量及培养基配方,对该重组蛋白的表达量进行研究。最终确定使用BMMY培养基、表达时间为96h、培养基装填量为10%时为最佳表达条件,在最佳表达条件下,该重组蛋白的表达量最高可达0.2g/L。     

巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌外源蛋白质表达的影响

目的构建蛋白酶缺失菌株,提高外源蛋白质表达的分泌率与产量。方法构建质粒pRS306/PEP4 L&R,利用基因重组原理剔除巴斯德毕赤酵母中的PEP4基因。比较基因剔除前后外源蛋白质表达量的差异。结果剔除毕赤酵母中的PEP4基因后外源蛋白质表达量平均提高9．5%。结论剔除毕赤酵母中的PEP4基因可有效地控制外源蛋白质MIP表达时的降解。     

有机磷农药降解酶基因Oph2的克隆及甲基对硫磷降解效果研究

摘要：目的 挖掘可高效表达农残降解酶的基因,并构建含有该表达基因的工程菌,以此提供一种高效去除有机磷农残的新方法。方法 利用基因克隆获得高效表达农残降解酶基因Oph2,采用基因工程手段将其转化至毕赤酵母表达系统,对毕赤酵母的发酵产物进行SDS-PAGE定性研究和酶活定量研究,最后通过与目标底物甲基对硫磷反应,分析工程菌表达降解酶对有机磷农残的去除效果。结果 本研究成功克隆得到了高效表达有机磷降解酶基因Oph2,基因全长1000bp,编码256个氨基酸,酶蛋白分子量为37KD,并利用表达载体pPIC9K成功将其转化至毕赤酵母GS115。构建的工程菌GS115-pPIC9K-Oph2表达有机磷降解酶活性为11.57 U/mL,对6.8 mg/L的甲基对硫磷降解效率为90%以上。结论 本研究得到的工程菌GS115-pPIC9K-Oph2可高效表达有机磷降解酶,该酶活性高,对有机磷农残降解能力强,可有效应用于有机磷农残的降解。     

嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因在地衣芽孢杆菌中的异源表达

为了考察重组地衣芽孢杆菌的异源表达特性,进一步提高麦芽四糖酶的发酵水平,以适用于工业化生产,研究构建了木糖诱导型的重组地衣芽孢表达系统,表达了来源于嗜糖假单胞菌的麦芽四糖酶基因,并进行了初步发酵优化。结果显示,构建的表达系统经过核酸电泳以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)鉴定均正确,该系统在发酵过程中经过木糖诱导,重组酶能够成功地分泌至发酵液中,然后通过对诱导剂添加时间、诱导温度和发酵时间优化后,摇瓶水平的最大酶活力可达(168. 2±9. 41) U/m L。最佳的发酵条件为,在24 h添加诱导剂,诱导温度30℃,发酵至稳定期结束停止发酵。该研究为重组地衣芽孢杆菌的异源表达研究以及麦芽四糖酶的工业化应用提供了参考。