出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的代谢通量及关键酶活性分析

野生型出芽短梗霉菌株TKPM00006及其诱变菌株CGMCC30007在相同条件下,使用5 L罐进行聚苹果酸发酵,分析这2株菌在相同发酵状态下发酵中后期代谢网络的代谢流分布和关键酶活变化,对出芽短梗霉合成聚苹果酸的机理进行探究。结果表明,菌株TKPM00006和菌株CGMCC30007的菌体生长情况相似,但产酸量分别为20.54 g/L和30.2 g/L。.通过代谢通量分析及关键酶活性的测定可知,丙酮酸羧化途径及乙醛酸途径是PMLA合成的主要途径,TCA循环途径在发酵后期比较弱,该结论通过添加代谢抑制剂及中间代谢物实验加以证明。酶活分析同时还证明了高产菌株比出发菌株的PMLA合成能力强主要是因为丙酮酸羧化途径的加强。根据实验分析可在丙酮酸节点进行靶点改造或通过发酵调控改变丙酮酸节点处碳架的分配,通过加强丙酮酸羧化途径来减少因副产物的生产而造成的碳架流失,达到增加聚苹果酸生物合成的目的。     

大肠杆菌产脂肪酶代谢通量分析

考察了5 L发酵罐中大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的发酵特性,诱导2 h后,脂肪酶比活达到最高值18. 11 U/mg。建立了E. coli代谢合成脂肪酶的反应网络,并通过代谢通量分析发现,经诱导产酶后,乳酸代谢通量增加,碳流通过糖酵解途径(embden-meyerhof-parnas pathway,EMP)生成乳酸,分流了部分合成生物量的碳流,降低了生物量合成的速率;缬氨酸通量的增加满足了脂肪酶合成的需求; ATP通量的减少,限制了脂肪酶的高效合成。该研究为进一步指导提高生产脂肪酶菌种的发酵条件优化和代谢途径改造提供了理论依据。     

乳酸代谢通量调控规律的研究

选取了8株嗜酸乳杆菌进行分批发酵培养,分别测定了它们对数生长期乳酸发酵途径中10种相关酶的活性,分析了乳酸的代谢通量,并首次引入数量遗传学方法利用通径分析研究了酶活性对乳酸通量的直接和间接影响,建立了类似于代谢控制系数的决定系数R2(i)。该系数实际上反映了酶对乳酸通量的控制程度,研究结果显示,丙酮酸激酶(R2(PK)=0.3705)、己糖激酶(R2(HK)=0.3053)、磷酸丙糖异构酶(R2(TPI)=0.2733)和乳酸脱氢酶(R2(LDH)=0.2601)对乳酸通量具有相对较高的决定系数,对乳酸通量起主要控制作用;3-磷酸甘油醛脱氢酶(R2(GAPDH)= -0.1320)的决定系数为负值,对乳酸通量具有较为明显的负控制作用。本文首次应用数量遗传学方法研究相关酶对乳酸代谢通量的控制作用,这将为代谢控制分析提供新的思路。     

乳酸发酵短杆菌中碳架流向赖氨酸的导向与分析

对乳酸发酵短杆菌生物合成赖氨酸的代谢途径及其代谢流量从理论上进行了分析，计算了乳糖发酵短杆菌合成赖氨酸的最大理论转化率。对代谢途径及其遗传调控进行了分析，通过NTG诱变育成了一株带有FP^S、AEG^r、Ma^r和Leu^-4种遗传标记的赖氨酸高产菌株，使赖氨酸的产量提高到54.6g/L，并分析了这些标记对代谢流量改变的影响。     

利用Biolog系统进行乳酸生产菌代谢能力的快速分析

利用Biolog系统考察目标菌株对产乳酸途径相关碳源的代谢能力,表明在厌氧条件下两自行筛选的候选菌株中S-18比菌株S-44具有更高的己糖激酶和乳酸脱氢酶等产乳酸代谢关键酶活力;通过好氧条件下产乳酸途径及旁路相关碳源利用能力的考察,显示在好氧条件下丙酮酸更易转向旁路代谢且L-乳酸脱氢酶受到强烈抑制,为乳酸发酵条件的优化与调控奠定了理论基础.利用Biolog系统对特定代谢途径代谢能力进行分析的方法具有快速、简便、重现性高的特点,并适合高通量分析的目的,可促进工业微生物代谢能力及代谢调控研究的普遍开展.     

基于乳糖水解酶的乳酸乳球菌乳糖代谢多样性研究

探究了磷酸-β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶对乳酸乳球菌乳糖代谢的影响。通过对12株乳酸菌在以乳糖为单一碳源环境下的生长、产酸、乳糖代谢情况、β-半乳糖苷酶和磷酸-β-半乳糖苷酶活力及发酵液中残留半乳糖含量进行测定,了解不同菌株乳糖代谢的差异。结果表明,不同的乳酸乳球菌乳糖代谢能力存在显著性差异;β-半乳糖苷酶活力较高的菌株发酵液中半乳糖含量为270～4 110 mg/L,而磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的菌株发酵液中半乳糖含量为40～900 mg/L;将磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的乳酸乳球菌与嗜热链球菌复配,发酵液中半乳糖含量较嗜热链球菌单菌发酵时显著降低。磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的乳酸乳球菌有助于降低发酵乳制品中的半乳糖含量。     

氧化还原电位调控对钝齿棒杆菌代谢通量分布的影响

研究不同氧化还原电位对钝齿棒杆菌厌氧发酵特性的影响,并对菌株的代谢通量分布特征进行了分析。结果表明,氧化还原电位由－56 mV降为－400 mV时,发酵液中琥珀酸质量浓度由14 g/L上升为20.2 g/L,乳酸质量浓度由44.9 g/L下降为35.2 g/L。代谢通量分析结果表明,降低氧化还原电位对6-磷酸葡萄糖与磷酸烯醇式丙酮酸节点处的代谢流分布影响显著。氧化还原电位为－400 mV时,胞内戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway,HMP）代谢通量与－56 mV相比增加了1.74 倍,由磷酸烯醇式丙酮酸流向C4途径的代谢通量与－56 mV相比增加了78%,琥珀酸通量由31.73 mmol/（L·g·h）增加到56.53 mmol/（L·g·h）,乳酸代谢通量由159.73 mmol/（L·g·h）下降为133.50 mmol/（L·g·h）。研究结果表明6-磷酸葡萄糖与磷酸烯醇式丙酮酸节点是影响钝齿棒杆菌厌氧发酵产琥珀酸的关键节点,为后期通过菌种改造以调节乳酸和琥珀酸的生成比、实现乳酸与琥珀酸联产奠定了基础。     

发酵产赤藓糖醇代谢调控研究进展

对赤藓糖醇的合成途径、关键酶及代谢调控方式等方面的研究进行综述。分析了利用代谢调控手段改变代谢途径的方法,并对未来赤藓糖醇合成途径调控机制在分子水平上的发展趋势进行展望。     

基于比较基因组学的Clostridium kluyveri己酸代谢途径关键酶生物信息学分析

对3?株白酒来源重要的己酸生产菌株Clostridium kluyveri（NBRC 12016、JZZ和DSM 555）全基因组信息进行比较基因组学分析,聚焦于己酸代谢途径核心催化酶,发现NBRC 12016的己酸代谢途径未得到有效注释,JZZ的己酸代谢途径核心催化酶酰基辅酶A脱氢酶存在注释错误。进一步对C. kluyveri模式菌株DSM 555己酸代谢途径的关键酶硫解酶ThlA进行生物信息学分析,发现DSM 555携带3 拷贝的ThlA,且具有序列多态性,可能与催化脂肪酸代谢链延长的底物特异性相关。结构分析和分子对接表明,硫解酶ThlA1的底物催化属于氧化还原开关调控机制,并预测了酶的关键催化位点和具体的催化过程。上述分析结果有助于为后续进一步改进菌株的己酸生产性能和更好地应用于白酒酿造提供依据。     

生物合成天然2-苯乙醇细菌的筛选及合成途径分析

从上海国家森林公园土壤样本中筛选到1?株菌株,经过生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,该菌属肠杆菌属并命名为Enterobacter sp. MF024。Enterobacter sp. MF024全基因组测序结果表明该菌株包含从头合成途径和艾氏途径合成2-苯乙醇所有关键酶的编码基因。分别以葡萄糖、L-苯丙氨酸为底物进行生物转化实验,并以苯乙醛、苯丙酮酸等合成途径中间产物为底物进行验证,气相色谱-质谱法、红外光谱分析结果进一步说明Enterobacter sp. MF024具备两种2-苯乙醇合成途径,且该菌利用从头合成途径和艾氏途径产2-苯乙醇产量分别达到0.56、1.15 g/L。该菌株以葡萄糖为碳源生物合成2-苯乙醇极具应用前景。     

Overproduction of glycolytic enzymes in yeast

Eight different enzyymes for glycolysis and alcoholic fermentation were overproduced in a common Saccharomyces cerevisiae strain by placing their genes on multicopy vectors. The specific enzyme activities were increased between 3·7-and 13·9-fold above the wild-type level. The overproduction of the different glycolytic enzymes had no effect on the rate of ethanol formation, even with those enzymes that catalyse irreversible steps: hexokinase, phosphofructokinase and pyruvate kinase. Also the simultaneous increase in the activities of pairs of enzymes such as pyruvate kinase and phosphofructokinase or pyruvate decarboxylase and alcohol dehyrogenase, did not increase the rate of ethanol production. The levels of key glycolytic metabolites were also normal, compared to the reference strain.     

Acetyl CoA carboxylase shares control of fatty acid synthesis with fatty acid synthase in bovine mammary homogenate

The objectives of this research were to determine the flux control coefficients for acetyl CoA carboxylase and fatty acid synthase using an in vitro preparation of bovine mammary homogenate. For an enzyme to be considered rate limiting with the use of metabolic control analysis, its control coefficient would be equal to unity. The hypothesis for this experiment was that the control coefficient for acetyl CoA carboxylase was not equal to unity, and that this enzyme was not, therefore, the rate-limiting step. Mammary tissue was isolated from lactating Holstein cows at slaughter and frozen in liquid nitrogen. Tissue was ground, homogenized, and centrifuged to obtain a postmitochondrial supernatant for use in in vitro incubations containing labeled acetate. Specific inhibitors for acetyl CoA carboxylase and fatty acid synthase were used to fractionally inhibit de novo synthesis for the calculation of flux control coefficients. The composition of fatty acids synthesized in the absence of enzyme inhibitors was similar to the composition of fatty acids in the presence of inhibitors. Calculations following avidin inhibition of acetyl CoA carboxylase determined the flux control coefficient was 0.63 ± 0.15, which means that 63% of the control of fatty acid synthesis is exerted by acetyl CoA carboxylase. The remaining control (37%) was from fatty acid synthase, which indicates a significant degree of control over the flux of acetate in de novo synthesis resides with this enzyme. The rate-limiting status ascribed to acetyl CoA carboxylase was not supported, because the flux control coefficient was less than unity. Metabolic control analysis, through its use of pathway product measurements, allows for potential interactions in the pathway such as feedback inhibition contribution to the flux control coefficients, which would not otherwise be considered in studies measuring enzyme kinetics with purified enzymes.     

乳酸盐通量及其控制分析:食品功能的定量化评价方法

目的:食品对机体的影响主要表现为对代谢和代谢网络的影响,本实验旨在研究食品对机体代谢作用的定量化评价方法。方法:通过对志愿者外周血采样,首先研究4 种生理状态(基础状态、学习状态、运动状态和发烧状态)下,乳酸盐代谢通量的变化,同时研究中心代谢途径中的15 种酶对乳酸盐代谢通量的控制作用;采用相关分析和主成分分析相结合的方法,研究酶的表达(或合成)量对乳酸盐代谢通量的作用,确定主成分及各种酶的控制系数。另招募健康志愿者,采集其食用大米变性淀粉前后的外周血样,运用已建立的代谢通量模型及控制分析方法对变性淀粉的功能性进行评价。结果:4种状态下乳酸盐代谢通量各不相同,由小到大依次为:基础状态、学习状态、运动状态和发烧状态,4种生理状态下机体内的分解代谢依次增强,可见乳酸盐代谢通量实质上反映了机体分解代谢(氧化磷酸化供能)的强弱。丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK,Cp PK=0.221 6),丙酮酸脱氢酶复合物(pyruvate dehydrogenase complex,PDHC,Cp PDHC=0.206 4),乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH,Cp LDH=0.162 6),转酮酶(transketolase,TKL,Cp TKL=0.206 0)对乳酸盐代谢通量起到主要作用,其中,PK的控制作用最强。志愿者食用变性淀粉后,乳酸盐通量增强,分解代谢增强而合成代谢减弱;PK的基因表达(合成)量显著增加(P=0.010.05),PDHC的基因表达(合成)量极显著降低(P=0.0030.01),说明所测酶的表达量与所预测的乳酸盐通量之间的拟合程度较好。结论:本实验建立的评价方法可以通过采集适量的外周血对食用食品后的人体代谢作用进行定量化评价。     

温度对Zymomonas mobilis糖代谢关键酶活力和代谢流量的影响

以运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）ATCC31821为模式菌株,研究不同温度条件对其葡萄糖代谢关键酶活力的影响。采用全自动发酵罐,在整个发酵过程中通过充入氮气调节发酵液的溶氧量（DO）=0%,添加0·5mol/LNaOH溶液控制pH=5·5,发酵温度分别控制为25、30、35、40℃,发酵24h,测定其糖代谢网络中ED、HMP、TCA等途径的关键酶活力和代谢物成分。结果表明,在发酵温度为30～35℃时,乙醇脱氢酶（ADH）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH）、丙酮酸脱羧酶（PDC）、葡萄糖激酶（GK）、丙酮酸激酶（PK）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GD-3-PDH）的活力较高,菌体的ED途径代谢活跃,碳素流量增加,乙醇生产量和糖转化率较高,而TCA途径的苹果酸脱氢酶（MDH）和异柠檬酸脱氢酶（ICDH）等活力较低,进入TCA途径的碳素流量明显减少;发酵温度为25、40℃时,TCA途径的酶活力升高,ED途径的酶活力减弱,生成乙醇的代谢流量减少,因此温度是Z·mobilis发酵过程中调控菌体细胞生长和糖代谢的一个重要因素。      

短梗霉生产聚苹果酸合成机制研究进展

聚苹果酸是一种可完全生物降解的高分子材料,具有高度水溶性、无免疫原性等优良特性,在生物医药及生物材料领域具有广泛应用前景。文章介绍了微生物法合成聚苹果酸的代谢途径、关键酶系及其代谢调控机制,展望了聚苹果酸合成代谢的研究方向。      

大肠杆菌合成琥珀酸的代谢工程研究进展

琥珀酸是一种重要的平台化合物,广泛地应用于食品、医药和化工等领域,被美国能源部列为12种最具潜力的可大宗生产的 化学品之首。 大肠杆菌（Escherichia coli）是目前生产琥珀酸的主要菌株,利用生物法发酵生产琥珀酸因具有原料可再生利用、绿色环 保等优势而成为当今研究的热点。该文从代谢调控的角度出发分析总结了大肠杆菌在发酵产琥珀酸中所应用到的方法策略,如消除 竞争途径、过表达关键酶、提供还原能量、扰动磷酸戊糖途径等,着重突出了代谢控制发酵产琥珀酸方面的研究进展,并对今后的发 展提供了新思路。