枯草芽孢杆菌产3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇发酵条件优化

研究以一株从古井窖泥中分离筛选的枯草芽孢杆菌为出发菌株,进行发酵培养成分和发酵条件优化。与静置发酵相比,振荡培养可有效提高菌株发酵液中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的产量;在振荡培养的基础上采用正交试验方法对发酵培养基和培养条件进行了优化。实验结果表明,枯草芽孢杆菌发酵培养的最佳条件为:3mmol/L Mg~(2+),15g/L蛋白胨,150r/min,32℃。与初始静置发酵条件相比,最优条件下3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇(左旋)、2,3-丁二醇(内消旋)的产量分别提高了57.75%、1234.96%、163.33%。     

响应面法优化枯草芽孢杆菌3-羟基丁酮发酵培养基

采用响应面法对枯草芽孢杆菌TH-55 3-羟基丁酮发酵培养基进行了优化,确定了葡萄糖、酵母浸膏和玉米浆是影响菌株3-羟基丁酮发酵产率的主要因素.优化获得的发酵培养基组成:葡萄糖102g/L,酵母浸提物6.8g/L,玉米浆26.5g/L,硫酸铵5g/L,硫酸锰0.05g/L,硫酸镁0.6g/L,磷酸二氢钾0.5g/L.在此条件下,菌株摇瓶发酵3-羟基丁酮平均产率达到46.25g/L,较优化前的菌株产率35.21g/L相比提高了31％.10L发酵罐发酵试验,发酵周期72h,3-羟基丁酮发酵产率达到47.85g/L.     

高温大曲中产吡嗪芽孢杆菌的分离鉴定及发酵产物分析

该试验从高温大曲中筛选产吡嗪芽孢杆菌（Bacillus）,通过形态观察及磷脂脂肪酸（PLFA）分析对其进行鉴定,并采用发酵试验分析其代谢产物。共筛选出3株芽孢杆菌,即菌株B1、B2、B3。经分析鉴定后得出：菌株B1为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）;菌株B2和B3为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。3株菌发酵产物分析结果表明,在液态发酵条件下3株菌发酵产吡嗪,其中菌株B2和B3发酵产物中吡嗪相对含量较高,均＞60%;固态发酵条件下生成吡嗪前体物质3-羟基-2-丁酮,且发酵产物中相对含量均＞75%。表明这3株芽孢杆菌对酱香型白酒风味物质的产生有着一定的影响。     

产3-羟基丁酮菌株的筛选及产物分析

从日本传统食品纳豆中分离筛选获得1株产3-羟基丁酮的菌株SF4-3,以葡萄糖为主要碳源,该菌株在37℃,180 r/min摇瓶培养96 h,3-羟基丁酮产量为33.90 g/L,利用气相色谱及气相色谱-质谱联用对菌株SF4-3的发酵液进行分析,结果表明主产物为3-羟基丁酮,纯度为95%以上,不产2,3-丁二酮或2,3-丁二醇。根据形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析,该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。     

紫外诱变选育高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌

选育高产3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌新菌株。采用紫外诱变(15W,25cm),对一株产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌YD-1进行紫外诱变处理,并对菌株的遗传稳定性进行测定。筛选获得4株高产菌MB-2、MB-6、MB-10和MB-11,经过20代传代培养后MB-2的遗传稳定性最好,其遗传物质经RAPD分析,与出发菌株YD-1相比有较大差异。该菌遗传性状稳定,是一株高产3-羟基丁酮的新菌株。     

发酵调味饮料酵母菌的筛选及其发酵性能研究

从当地制作面包面泥中分离酵母菌,以产酒精和3-羟基丁酮为参考指标,通过三级筛选,筛选出一株适合发酵调味饮料用的产酒低、产香性能优的酵母SD-01。通过个体形态、菌落特征、生理生化分析,SD-01鉴定为酿酒酵母。将SD-01接入到麦汁培养基中,不同温度下产3-羟基丁酮、酒精不同,其中26℃下发酵条件最好,其酒精量为0.98g/dL,3-羟基丁酮最高为0.97g/L。在26℃下研究了菌种生长、代谢还原糖、产酸、产酒、产3-羟基丁酮的规律,为发酵生产提供借鉴。最终筛选的酵母菌因其产酒低、3-羟基丁酮高加之发酵产生丰富的有机酸,为发酵调味饮料生产提供了一株发酵性能良好的酵母。     

一株高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌的构建

以产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TH-49(Val-)和产α-乙酰乳酸脱羧酶地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)AD-30为亲本菌株,以聚乙二醇为融合促进剂,进行原生质体融合获得融合子,融合子经再生、筛选等过程,最终获得高产3-羟基丁酮菌株HB-32,该菌株3-羟基丁酮产量高达49.64 g/L,比菌株TH-49(Val-)提高了61.8%,且遗传稳定性良好。进一步采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,从分子水平上分析了高产3-羟基丁酮菌株HB-32与亲本菌株基因组的变化。结果表明,枯草芽孢杆菌(B. subtilis)TH-49(Val-)和地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)AD-30原生质体融合成功,提高了融合子HB-32 3-羟基丁酮产量。     

高产3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇菌株的筛选及其应用研究

研究从古井贡酒窖泥中筛选出了一株高产3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇的功能菌,编码为GJJN BL0101,结合功能菌的形态学特征、Biolog微生物鉴定及分子生物学鉴定结果,该菌种为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens),其代谢产物3-羟基-2-丁酮为6000mg/L、2,3-丁二醇为30000mg/L。同时我们对该功能菌在白酒酿造中的应用进行了初步研究,将功能菌发酵液按一定比例加入出池酒醅进行蒸馏,可大幅提高基酒中3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇的含量,研究结果表明,该菌株在发酵工业中具有应用潜力。     

生姜产香内生真菌的分离鉴定及其挥发性成分分析

对新鲜生姜的内生真菌进行分离纯化,共获得17株纯系微生物,通过筛选获得1株产香浓郁的菌株,利用GC-MS对其发酵产物进行分析.结果表明,该菌株代谢产物的香气成分主要为3-羟基-2-丁酮(44.08％)、3-(1,1-二甲基乙基)-噻吩(5.4％)、3,4-二氢-8-羟基-3-甲基异香豆素(6.19％)、1,2-苯二甲酸丁基二甲基酯(5.68％)等.所有挥发性成分中酮类和酯类所占比例最大,酮类有10种,占总含量的50.94％,酯类有7种,占总含量的17.73％.     

利用地衣芽孢杆菌发酵生产3-羟基-2-丁酮初步研究

初步研究了摇瓶条件下地衣芽孢杆菌发酵生产3-羟基-2-丁酮的工艺条件。分析了摇瓶发酵中菌体生长、产物合成和pH的变化情况;考察了发酵温度、装液量、种龄、接种量等条件对发酵的影响;研究了地衣芽孢杆菌利用不同碳源发酵生产3-羟基-2-丁酮的情况,选取了最适碳源,在此基础上进行了补糖试验;最后采用正交试验方法对培养基进行了优化。在优化的发酵条件下,采用分批补糖的工艺,摇瓶发酵产量可稳定在20 g/L以上,为3-羟基-2-丁酮的工业化生产提供了一定的基础。     

原生质体融合提高产谷氨酰胺转氨酶菌株产量

目的：研究并建立产谷氨酰胺转氨酶茂原链霉菌原生质体制备技术,通过原生质体融合技术筛选高产菌株。方法：以溶菌酶处理茂原链霉菌获得原生质体,采用原生质体融合技术,通过96 孔板高通量初筛、试管复筛、摇瓶验证选育高产菌株。结果：茂原链霉菌形成的原生质体再生出的菌落直径比较小,而菌丝生成的菌落直径比较大,两种形态的菌落96 孔板发酵后酶活力有显著性差异。不同的茂原链霉菌株制备原生质体,酶解程度、原生质体纯度、再生率有很大的差异,再生率最高可达1 804.25%,最低仅为12.76%。原生质融合后的高产菌株,选取96 孔板初筛酶活力前3%的菌株进行试管发酵,得到高产菌株比例为32.2%,酶活力比亲本高22.4%,经摇瓶验证产酶比对照提高16.28%。结论：利用基因组重排技术,可以初步对茂原链霉菌进行高产菌株选育。     

优良菌株组合发酵对醋醅中川芎嗪及其前体合成的影响

该研究监测山西老陈醋醋酸发酵和熏醅过程中川芎嗪及其前体物质的变化,并对高产乙偶姻及川芎嗪菌株进行筛选及共培养,优选高产菌株组合,在醋醅模拟培养基中添加优良菌株组合联合底物及前体物质,考察其对乙偶姻和川芎嗪生成的影响。结果表明,丙酮酸、2,3-丁二醇和乙偶姻在醋酸发酵阶段呈现上升趋势,在熏醅阶段,2,3-丁二醇和乙偶姻呈下降趋势,丙酮酸含量变化不大;川芎嗪则主要在熏醅阶段生成,从熏醅第2天的6.78 μg/g急剧上升到熏醅第5天的43.52 μg/g。在醋醅模拟培养基中添加莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）B15+甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）B6+丙酮酸组合,川芎嗪生成量最高,达到15.76 μg/g,比对照组提高132.79%。     

96孔板高通量选育产乙醇酵母

以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),安琪酵母(Angel yeast),酿酒酵母(Sacchro-myces cerevisiae)等4株菌为出发菌株,经过紫外诱变,96孔板高通量筛选出60株,复筛选出4株.最大乙醇产量提高到76.6g/L,糖醇转化率达到了0.488g/g.对上述4株菌进行耐乙醇性能驯化,发酵耐乙醇能力达到15%.     

高通量筛选葡萄糖酸钙高产菌株

以黑曲霉为研究对象,建立了高通量筛选葡萄糖酸钙高产菌株流程。结果表明:紫外线-LiCl复合诱变处理的黑曲霉孢子悬浮液,高通量筛选得到4株高产菌株,传代后发酵性能稳定。菌株P-9,其发酵液葡萄糖酸钙含量达到23.04 g/100 mL,比原始菌种高5.86 g/100 mL。相较于传统摇瓶发酵筛选工作量大,周期长,该方法显著提高了筛选效率。     

抗食品腐败真菌的乳酸菌筛选、复配及混合发酵工艺优化

应用化学防腐剂控制食品中腐败微生物,防腐剂残留对人体具有一定的潜在性危害。本文筛选抗食品腐败真菌的乳酸菌,并对其进行复配及混合发酵以提高其发酵液抗真菌活性。通过24孔板双层琼脂法及分级抑菌浓度法从多株乳酸菌和丙酸杆菌中筛选抗真菌较强的菌株并确定混合菌最优组合。通过Plackett-Burman试验,最陡爬坡试验,对其发酵工艺进行优化,用96孔板酶标仪法测其发酵上清液的抗真菌活性。结果表明:最优混合菌组合为植物乳杆菌L9和费氏丙酸杆菌D5;发酵培养基优化配方:葡萄糖55 g/L,碳酸钙6.7 g/L,酵母浸粉14.8 g/L,磷酸氢二钾 0.25 g/L,硫酸锰 0.1 g/L,乙酸钠 5.0 g/L,柠檬酸铵 2.0 g/L,接种比例为5:1（D5:L9）,发酵温度为37 ℃。对筛选出的L9和D5在优化后的发酵培养基进行混合发酵验证,其发酵液抗真菌活性可高达47.07 AU。     

红曲色素高产菌株的高通量选育

该文结合24深孔板微型化培养和酶标仪检测,建立了红曲色素高产菌株的高通量筛选方法,此法简单、快速、准确且自动化水平较高.确定最佳培养条件为装液量1.2mL/孔(每孔体积为10mL),接种量9％;找出红曲色素最大吸收峰值,确定酶标仪检测波长为530nm;通过紫外-氯化锂复合诱变处理,经过高通量筛选获得9株正突变株,其中菌株D39微孔板发酵色价达42.7U/mL,比出发菌株提高了46.2％;将D39分离纯化并用摇瓶验证,得到纯菌株D39-4的摇瓶发酵色价为206.5U/mL,比出发菌株提高了51.1％,具有很好的工业应用前景.     

高效液相色谱法检测枯草芽孢杆菌发酵液中乙偶姻和2,3-丁二醇含量

枯草芽孢杆菌可发酵代谢产生乙偶姻和2,3-丁二醇(两者可逆转化),本研究建立了用高效液相色谱法同时检测发酵液中乙偶姻和2,3-丁二醇的方法。对比了不同色谱柱和流动相配比对乙偶姻和2,3-丁二醇含量的测定结果,进一步检测枯草芽孢杆菌发酵液中乙偶姻和2,3-丁二醇含量。结果表明:采用Bio-Rad Aminex HPX-87H Column分析;流动相:0.005 mol/L的硫酸溶液;流速:0.5 mL/min;柱温:28℃;示差检测器,在30 min内完成样品检测,乙偶姻和2,3-丁二醇标准曲线相关系数分别为0.9997和0.9998,精密度标准偏差分别为1.76%和1.74%,稳定性标准偏差分别为1.2%和1.6%,回收率为98.93%~102.10%,相对标准偏差≤ 2%。此方法简单准确,检测目标物浓度为50 g/L,检测结果重现性好,发酵液中乙偶姻和2,3-丁二醇含量呈负相关,乙偶姻的含量随着2,3-丁二醇的增加而降低,该方法适合枯草芽孢杆菌发酵液中乙偶姻和2,3-丁二醇的发酵检测。     

山西老陈醋醋醅中醋酸菌的分离、ERIC分型及发酵特性研究

通过传统微生物培养分离手段从山西老陈醋醋醅中分离醋酸菌,采用形态学观察及分子生物学技术对其进行鉴定,并对分离菌株进行肠杆菌基因间保守重复序列（ERIC）分型及发酵特性研究。结果表明,共分离筛选出20株醋酸菌,经鉴定18株为巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）,2株为醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）。经ERIC分型,18株巴氏醋杆菌属于5个分型（Ⅰ～Ⅴ型）,2株醋化醋杆菌属于2个分型（Ⅰ和Ⅱ型）。经发酵特性研究,巴氏醋杆菌、醋化醋杆菌中Ⅱ型菌株的温度耐受性均优于Ⅰ型;巴氏醋杆菌Ⅰ型菌株产酸、产乙偶姻能力优于其他型的菌株。在此基础上,筛选出的1株性能优良的菌株,为巴氏醋杆菌SAV-CP 1884,其可耐受高温45 ℃、酒精度10%vol及pH 3,乙酸产量高达9.87 g/L、乙偶姻产量为0.86 mg/mL。     

发酵液中3-羟基丁酮的乙醇-磷酸氢二钾双水相体系分离

微生物发酵法生产3-羟基丁酮亟待解决的一个问题是它的下游分离工艺的确定,双水相萃取技术作为一种高效而温和的分离技术,已经在有机物质的分离提取中得到了广泛的应用,本文开展了该双水相萃取技术分离发酵液中3-羟基丁酮的研究,考察了双水相体系的种类以及组成比例对3-羟基丁酮萃取的影响,确定最佳的双水相体系为无水乙醇/磷酸氢二钾,当无水乙醇的质量浓度为26%(m/m),磷酸氢二钾的质量浓度为25%(m/m),此时的3-羟基丁酮分配系数为16.81,回收率高达98.2%,放大操作表明该双水相体系的稳定性较好,体系规模的改变不会影响到3-羟基丁酮的分配系数和回收率,适用于大规模工业化生产,并且通过减压蒸馏和结晶得到了3-羟基丁酮二聚体产品,进一步验证了该工艺在3-羟基丁酮分离中的应用潜力。