硫酸二乙酯化学诱变选育高核糖核酸酿酒酵母及培养基组成优化

该研究以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY23为出发菌株,采用硫酸二乙酯（DES）对其进行化学诱变,筛选出一株生长性能好、胞内核糖核酸（RNA）含量高的突变株BY23-195,并以胞内RNA含量为评价指标,通过单因素及正交试验对其糖蜜培养基成分进行优化。结果表明：突变株BY23-195生长性能较好,在酵母浸出粉胨葡萄糖（YEPD）培养基中,RNA含量较出发菌株BY23提高了18.85%。最优糖蜜培养基组分为糖蜜（糖度调至12 °Bx）、酵母浸粉5%、硫酸铵0.05%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸亚铁0.05%、硫酸锌0.10%。在此最优培养基组成下,突变株BY23-195胞内其RNA含量达到16.01%,较优化前（13.66%）提高了17.20%。     

富核糖核酸热带假丝酵母发酵培养基优化

以热带假丝酵母（Candida tropicalis）AY91009为试验菌株,以其核糖核酸（RNA）含量为目标,选取糖蜜为碳源,采用响应面法对其发酵培养基进行优化,建立酵母浸粉、NH4Cl和ZnSO4·7H2O的二次回归模型,确定培养基最佳配方为：糖蜜（30%含糖量）140 mL/L、酵母浸粉2.90%、NH4Cl 1.37%、NaH2PO4·2H2O 0.10%、MgSO4·7H2O 0.20%、FeSO4·7H2O 0.05%、ZnSO4·7H2O 0.10%。在此优化培养基中发酵培养12 h,RNA含量达到11.58%,比优化前提高了35.6%。20 L罐分批发酵试验结果表明,细胞干质量达到32.38 g/L,RNA含量为6.69%,总RNA含量为2.17 g/L,为后续的高密度发酵研究奠定了良好的基础。     

高产核酸的热带假丝酵母诱变选育及其发酵条件优化

以热带假丝酵母（Candida tropicalis）HY4-17为出发菌株,采用电子束辐射技术诱变,经过初筛、复筛及遗传稳定性试验选育核酸高产菌株,通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验及响应面法优化培养基,并优化接种量和发酵时间以提高核酸产量。结果表明,获得一株生长快速,遗传稳定的突变菌株EBI-21,其核酸含量较出发菌株HY4-17提高了25%。最佳培养基组成为：糖蜜185 g/L,硫酸铵3 g/L,硫酸锌0.05 g/L,硫酸镁0.5 g/L,硫酸亚铁0.05 g/L,磷酸1 mL/L,pH值为4.5。在优化培养基及接种量8%,发酵时间12 h条件下,核酸产量达到1.73 g/L,较未优化前提高了80.21%,培养时间缩短了10 h。     

L-异亮氨酸菌种选育及发酵条件优化

以栖糖蜜棒杆菌（Corynedacterium melassecola）ATCC17965为出发菌株。根据代谢控制发酵原理。经硫酸二乙酯和60^Co诱变处理。定向选育出一株L-异亮氨酸产生菌131-5（SG^r＋LeuME^r＋Leu＋AHV^r＋Suc^g＋Eth^r）。在培养基未经优化的情况下产L-异亮氨酸14-15g／L．同时，考察了培养基及发酵每件对茼株产酸的影响，在优化的培养基和发酵条件下积累L-异亮氨酸19．2g／L．最高时可迭21．3g／L．     

粘红酵母胡萝卜素高产菌株的诱变选育

以甘蔗糖蜜为碳源,摇瓶发酵初筛,从10株酵母茵中筛选得到一株生物量和胡萝卜紊含量均较高的菌株R3。利用紫外诱变,选育出一株正突变菌株R3-25,在同等发酵条件下,生物量达到11、34mg／L,胡萝卜素含量0.767mg／g,胡萝卜素产量为8.70mg／L,比出发菌株提高了1.90倍。该菌株连续10次传代,其产量性状无大变化,遗传性状稳定。     

YE专用高蛋白高RNA酵母菌株的筛选及鉴定

为筛选适合生产酵母抽提物(Yeast extract,YE)的高蛋白、高RNA酵母菌株,对来自安琪酵母公司野外采集保藏的酵母菌进行摇瓶活化、稀释涂布和划线纯化,获得酵母菌150株。通过摇瓶培养进行初筛,得到5株高蛋白、高RNA酵母。经过30 L小试发酵复筛,获得1株酵母菌株J-5。该酵母菌发酵后蛋白质含量平均达59.4%,RNA含量达9.86%,干重41.58 g/L。并对菌株J-5发酵活力、海藻糖含量测定,结果表明该菌株发酵活力、海藻糖积累量均较低,为酵母抽提物生产优良菌株。通过形态学、生理生化及26S r DNA序列同源性分析,初步鉴定菌株J-5为酵母属酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。     

优良降酸酵母菌的筛选及发酵性能

以能够降解L-苹果酸的酿酒酵母FM-cs-08为出发菌株,分别进行紫外诱变和60Co诱变,旨在诱变得到降酸能力显著提高又具有良好发酵性能的酿酒酵母菌。最终筛选得到诱变菌株FM-cs-08-2U,降L-苹果酸比率达到（29.48±0.21）%,比出发菌株提高了（25.44±0.89）%。对诱变菌株FM-cs-08-2U的耐受性及发酵特性进行研究,结果表明该菌株耐受最低pH值为2.5,耐受最高SO2质量浓度为800 mg/L。用FM-cs-08-2U发酵蓝莓果酒,得到果酒残糖量（3.70±0.10）g/L,pH值为3.18±0.01,有机酸含量（8.64±0.02）g/L,酒精度（12.00±1.00）%,结果证明菌株FM-cs-08-2U适合酿造蓝莓果酒。     

甘蔗糖蜜发酵培养高铁营养酵母的菌种诱变选育

经过抗性筛选和摇瓶发酵培养，从25株酵母菌中筛选到一株能以甘蔗糖蜜为碳源的生物量较高及富铁能力较强的菌株R4—5。利用^60Co辐射诱变，选育出一株正突变菌株R4—5—27，在同等发酵条件下，生物量达到10．25mg／L，铁含量7．43mg/g，总铁含量为76．16mg/L，比出发菌株提高了1．59。连续10次传代，其产量性状无大变化，表明该菌株遗传性状稳定，极有潜力改良为工业化生产菌种。     

利用甘蔗糖蜜发酵生产酵母单细胞蛋白的菌种选育

以甘蔗糖蜜作为发酵原料,经过摇瓶发酵培养,筛选得到一株总蛋白得率较高的啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S9。以S9为出发菌株进行60Co诱变选育实验,筛选到一株高生物量高蛋白含量的S906突变菌株,在相同的发酵条件下,生物量为11.25g/L,蛋白质质量分数为45.96%,总蛋白质得率达5.17g/L,比诱变前增加了39.0%。S906传代10次,其生物量、细胞粗蛋白含量无大的变化,表明该菌株遗传性状稳定,经过改良可作为工业化生产单细胞蛋白菌株。     

富含谷氨酸酿酒酵母的筛选及发酵培养基优化

从农家自酿葡萄酒中筛选出一株富含谷氨酸酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）F-5,其26S rDNA核苷酸序列与S. cerevisiae TY12的26S rDNA核苷酸序列同源性为100%。以胞内谷氨酸含量为目标,采用响应面法对其发酵培养基进行了优化,建立糖蜜、工业蛋白胨和KH2PO4的二次回归模型,确定培养基最佳配方为：糖蜜（含30%蔗糖）100 mL/L、酵母浸粉10 g/L、工业蛋白胨20 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 2 g/L。在此优化培养基中发酵培养24 h,胞内游离谷氨酸达到了3.29%,比优化前提高了87.8%。     

用分子生物学手段控制啤酒中乙醛含量的研究

以F718,R719为引物,以质粒pFA6a—kanMX4为模板进行PCR扩增,采用基因转化法获得1株乙醇脱氢酶Ⅱ基因突变型工业酿酒酵母。驯养后的突变株啤酒生产小试表明,突变株乙醛含量为5．386mg／L,比原菌株乙醛含量7．932mg／L有所降低;发酵液发酵结束时,双乙酰含量为0．058mg／L,比原菌株双乙酰含量0．034mg／L有所升高;突变株发酵度为63％,比原菌株66％略有降低。     

以大豆糖蜜为原料高产乙醇酵母的筛选鉴定及其发酵特性研究

从大豆糖蜜中进行高产乙醇酵母的筛选和鉴定,并对其发酵特性进行研究。从大豆糖蜜中通过菌种的富集分离,TTC平板法初筛,耐乙醇能力及乙醇发酵能力的测定,筛选出一株乙醇产量达9.07%(V/V)的菌株P14。通过个体形态、菌落特征、生理生化及26S rDNA D1/D2区序列分析将菌株P14鉴定为酿酒酵母。研究了大豆糖蜜浓度及添加氮源和无机盐对酿酒酵母P14发酵生产乙醇的影响及酿酒酵母P14对大豆糖蜜中低聚糖的利用,结果表明大豆糖蜜浓度、添加氮源和无机盐对乙醇发酵影响显著,最佳的大豆糖蜜浓度为40%,添加氮源为1.2 g/L的蛋白胨;补加的无机盐为0.4 g/L MgSO4。在此培养基中发酵72 h后,糖蜜中90.10%的葡萄糖,91.23%的蔗糖,92.56%的棉籽糖和96.97%的水苏糖被酵母利用。因此大豆糖蜜中筛选出来的酿酒酵母P14具有较强的利用大豆糖蜜中的大豆低聚糖发酵产生乙醇的能力。     

海洋源纤溶酶高产菌株的诱变育种及液体培养基优化

为获得纤溶酶高产菌株及其最优发酵条件,以海洋环境来源的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）H-A-03为出发菌株,经过60Co辐射诱变获得了一株遗传稳定性好的纤溶酶高产菌株F8-C,其酶活力较出发菌株提高28.78%。采用统计学优化方法获得了组分更简单、用量更少、更利于菌株产酶的培养基：可溶性淀粉41.6 g/L、黄豆粕粉26.2 g/L、CaCl2 1.0 g/L,KH2PO4 2.0 g/L。在此基础上,3 L摇瓶放大试验结果显示,菌株F8-C的产酶量达到（3 231±21） U/mL,较出发菌株H-A-3提高44.8%。结果表明利用60Co辐射诱变育种,并采用统计学方法优化培养基,对于提高枯草芽孢杆菌纤溶酶的产酶量是一种有效策略。该研究结果也将为下一步发酵罐扩大试验奠定基础。     

紫外诱变选育出芽短梗霉高产普鲁兰糖白化突变菌株

为了发酵获得无色素普鲁兰糖,对菌株Aureobasidium pullulan NG进行紫外诱变,成功获得一株高产普鲁兰糖的白化突变株UVMU3-1。将突变菌株与野生菌株比较发现,其菌体生长能力和分化能力未发生显著改变。突变菌株产出的多糖经红外光谱鉴定为普鲁兰糖,罐发酵实验表明突变菌株产糖能力强于野生菌株。在未经培养基和培养条件优化的情况下,罐发酵的糖转化率可以达到52.78%。突变株UVMU3-1可作为工业发酵普鲁兰糖的潜力菌株。     

一株耐高乙醇和低pH己酸产生菌Lysinibacillus fusiformis- pBE3-ep-SigB的构建

以Lysinibacillus fusiformis为出发菌,分别转染SigA和SigB突变基因,获得耐高乙醇和低pH胁迫的优良己酸产生菌。以pET32a（+）-SigA/SigB为模板,采用均匀试验优化SigA/SigB易错聚合酶链式反应（ep PCR）扩增体系中的Mn2+和Mg2+浓度,通过ep PCR获得ep-SigA/SigB突变基因,与载体pBE3-MCS连接后,构建L. fusiformis-pBE3-ep-SigA/SigB突变菌体库,将两种菌体库在pH值2～5和乙醇含量2%～12%条件下进行筛选。结果表明,L. fusiformis-pBE3-ep-SigB重组菌株耐受最高乙醇含量为8%左右,最低耐受pH值为2.5左右;当乙醇含量为8%、pH值为3.5时,L. fusiformis-pBE3-ep-SigB重组菌株的己酸产量达到（254.35±39.74） mg/100 mL,显著高于工程菌株L. fusiformis-pBE3-ep-SigA的己酸产量（P＜0.01）,且为出发菌L. fusiformis己酸产量（93.62±10.33） mg/100 mL的271.68%,表明L. fusiformis-pBE3-ep-SigB重组菌株具有较强的抗高乙醇浓度和低pH值胁迫产己酸的能力。     

构建ADH2和THI3基因敲除酿酒酵母用于降低糯米酒中高级醇的研究

为了降低糯米酒高级醇含量,以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株XF1的单倍体XF1a7和XF1α6为原始菌,采用Cre/loxP同源重组系统构建乙醇脱氢酶基因ADH2和类丙酮酸脱羧酶基因THI3缺失的单倍体酵母,再通过单倍体的杂交构建ADH2单基因缺失双倍体酵母XF1-A和ADH2与THI3双基因缺失的双倍体酵母XF1-AT。结果表明,重组菌XF1-A、XF1-AT与原始菌XF1的生长性能相似,菌株XF1-A和XF1-AT的基本发酵性能与菌株XF1无显著差异,菌株XF1-A酿造糯米酒中高级醇含量为522.16 mg/L,比菌株XF1低11.16%;菌株XF1-AT的高级醇含量为462.03 mg/L,比菌株XF1低21.39%。综上,ADH2和THI3基因敲除酿酒酵母能够有效降低糯米酒中高级醇生成量。