优化感受态细胞制备方法提高转化效率的研究

通过研究不同生长状态、处理溶液、保存时间及热激时间对感受态细胞制备的影响,分析了影响大肠杆菌株JM109和DH5α感受态细胞形成因素,优化了制备感受态细胞的方法。结果表明,OD600为0.43的大肠杆菌菌液经处理液（20 mmol/L MgCl2＋80 mmol/L CaCl2）处理,-85℃放置12～14 h,42℃热激处理90 s,转化效率最高,可达5.5×10^5～6×10^5 cfu/μg DNA（pSilencer2.1-U6-neo）,随着质粒放置时间增加,转化效率下降。     

一种改良的大肠杆菌质粒平板转化方法

改良了大肠杆菌质粒平板转化法,在储存液中添加PEG(聚乙二醇)、MgSO4和甘油,在-30℃保存受体大肠杆菌细胞,然后将保存菌与分子量大小不同的质粒DNA混匀,直接在Ca2+离子选择平板上进行转化和筛选。改良的平板转化法对大分子量DNA的转化无论在转化效率还是转化保持能力上都大大优于传统CaCl2转化法。     

不同方法转化大肠杆菌和农杆菌转化效率的研究

将pBI121质粒采用冻融法和热激法转化大肠杆菌,用冻融法转化农杆菌。经Gus染色和电泳检测,获得了含有pBI121质粒大肠杆菌的DH5α和JM109菌株,以及农杆菌EHA105和LBA4404菌株,同时探讨了影响大肠杆菌和农杆菌转化效率的主要因素。结果表明,大肠杆菌感受态细胞在4℃保存18 h时转化效率较高,用甘油低温冻存的感受态细胞20 d具有感受性,但转化效率较低。农杆菌OD6000.45～0.65时转化效率较高。     

HPV16 E6基因原核表达质粒的构建

对构建HPV16 E6基因的原核表达质粒pET28a(+)-HPV16 E6进行研究.从宫颈癌细胞株CaSki细胞中提取的的DNA基因组为模板,设计一对特异性引物,用PCR法扩增出HPV16E6基因片段.HPV16E6基因片段和质粒pET28a(+)经NcoⅠ和HindⅢ双酶切后用T4 DNA连接酶连接.构建的重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6转化大肠杆菌DH5α,经PCR鉴定和酶切鉴定筛选出阳性克隆,将阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌BL21 Star-DE3 Plyss中,构建了HPV16 E6基因原核表达质粒pET28a(+)-HPV16E6.HPV16E6基因原核表达质粒pET28a(+)-HPV16 E6的构建为HPV16 E6重组蛋白的制备和为宫颈组织HPV16型感染的早期诊断和相关治疗性疫苗的研制奠定了物质基础.     

几种常用基因工程受体菌转化效率的比较

用Birnbom等人的方法从大肠杆菌中提取pSDM21质粒,并通过超离心进一步纯化。以已知浓度的λDNA为标准,测定pSDM21质粒的浓度为0.3μg/μl。用纯化的pSDM21质粒转化5株常用的基因工程受体菌,其转化效率为3.8×10~3——4.1×10~4。通过比较,可以看出大肠杆菌ED8654是基因工程研究中比较理想的受体菌。     

crtE、crtY、crtI、crtB基因共调控提高β-胡萝卜素产量

代谢合成途径优化的关键在于途径中多个基因表达的调控,本研究使用不同强度启动子对代谢通路中多个相关基因同时调控以提高大肠杆菌β-胡萝卜素产量。将来源于P.agglomerans的4个基因crtE、crtY、crtI、crtB,通过Golden Gate DNA方法与不同强度启动子组合得到质粒库,并转化到底盘细胞中进行颜色筛选。筛选得到crtE、crtY、crtI、crtB启动子组合各不相同的菌株,β-胡萝卜素产量在0.64~8.82mg/g,最高产量比对照提高了65.2%。本研究验证了通过Golden Gate组装建库对代谢通路多个基因同时调控以提高目的产物产量的可行性。     

超声辐照对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的影响

以革兰氏阴性细菌大肠杆菌和革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌为研究对象，考察了超声条件对细菌灭活效果的影响以及相应的超声处理对细胞损伤、修复与细胞结构的影响，以衡量超声杀菌效率及随后的生物安全性问题．结果表明：超声条件增强，灭活效果提高；大肠杆菌对超声处理敏感，而金黄色葡萄球菌则有较大阻抗作用；超声处理对细胞没有显著的亚致死损伤，主要是直接致死；处理样在4℃低温保藏后活菌数皆下降，而在30℃保藏则略有提高；细胞内紫外吸收物质随着处理强度增大而漏出量增大，认为与细胞结构破损直接相关；电泳结果显示超声处理对胞内基因组DNA无明显影响。     

纤维素酶E5基因在E．coli中的克隆与表达

将含纤维素酶E5基因的质粒pD541用Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后,经电泳分离获取含E5基因的小片段,将该片段定向插入表达质粒pSE420的多克隆位点上,进一步将重组DNA转人大肠杆菌宿主．采用刚果红染色法检测出选择性平板上的转化子具有羧甲基纤维素酶(CMCase)活性．摇瓶产酶试验进一步表明,基因重组后的大肠杆菌能高效表达E5基因并将产物分泌出胞外,培养液中可检测到的CM-Case活力达31．6U／mL．该研究结果为进一步构建高效纤维素分解菌株打下了良好的基础,具有重要的学术意义和实际应用价值．     

Fe^3＋离子修饰的金纳米粒子对DNA的高效吸附

在谷胱甘肽功能化的金纳米粒子表面螯合Fe^3＋离子后,研究了DNA分子在不同p H和盐浓度条件下在粒子表面的吸附和脱附行为。在pH〈4.0的条件下,DNA通过所含的磷酸根基团与粒子表面的Fe^3＋离子产生配位相互作用而吸附到粒子表面,此过程受盐浓度影响不大。当pH〉4.0时,由于溶液中氢氧根离子的竞争作用,使DNA的磷酸根基团不能与Fe^3＋离子配位,此时只能通过静电或氢键作用吸附,但是吸附效率很低。因此,Fe^3＋离子修饰的金纳米粒子只在低p H条件下可以实现对DNA的高效吸附。这种基于配位作用的吸附效率要高于盐桥作用,而且不会受到溶液中盐浓度的影响。     

哈茨木霉Chiv基因的原核表达及优化

通过筛选哈茨木霉的DNA文库,克隆到Chiv基因的cDNA全长序列.以连接有哈茨木霉Chiv基因的质粒pBK902为模板,设计含有EcoRI和XhoI酶切位点引物,采用PCR方法扩增得到具有完整开放阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上并转化大肠杆菌BL21菌株中,成功地获得了大量的阳性转化子.质粒通过EcoRI和XhoI酶切鉴定及测序鉴定,证明Chiv基因成功地转化到大肠杆菌中.重组大肠杆菌经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现特异的蛋白表达条带,其分子量为50 kDa左右.通过对诱导剂量与诱导时间等因素的优化,结果显示几丁质酶的最佳诱导时间为13 h,最佳诱导剂浓度为1 mM,为几丁质酶的工业化生产奠定基础.     

骨形态发生蛋白-2基因工程菌的构建及可溶性研究

骨形态发生蛋白是一类调节骨组织发育的生长因子,其中骨形态发生蛋白-2诱导成骨活性最强,在骨组织工程研究中最具研究意义.为获得能高效表达溶解性高的人骨形成蛋白-2(BMP-2)的基因工程菌,用PCR方法扩增得到BMP-2的基因序列,直接将PCR产物连接到胞内融合表达型T载体质粒pMT-L上,构建包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、连接肽、6个His、EKsite(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和BMP-2的表达载体,转化E.coli DH5α,经抗性筛选和菌落PCR鉴定,抽提阳性克隆质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3),成功构建可在大肠杆菌细胞质内表达MBP-BMP-2融合蛋白的基因工程菌.工程菌经0.1mmol/L IPTG诱导后,可获得表观分子量约为55kD的以可溶形式表达的BMP-2融合蛋白.     

大肠杆菌ATCase抗反馈抑制突变体的构建及其对胞苷积累的影响

为解决胞苷生物合成途径中天冬氨酸氨甲酰转移酶受胞苷三磷酸反馈抑制调节的问题,通过对其碱基序列和蛋白质结构分析,利用基因定点突变的方法构建了大肠杆菌的ATCase突变酶,得到三个突变体：M1（H20L）、M2（K60E）、M3（K94E）,并在E.coli DH5α中对融合蛋白进行了表达．酶活测定表明,M1、M2、M3的ATCase酶相对活性都比野生型M0的高,分别为野生型M0的1．10、1．22和1．37倍,且比活力都有不同程度提高．与含野生型pyrBl基因的M0相比,含突变型基因的M1、M2和M3均对15mmol／L的CTP具有强的抗反馈抑制作用,且M1、M2和M3的抗CTP反馈抑制作用分别是M0的5．4、6．0和8．5倍．最后将各突变质粒转入到E．coli Cytl0（Acdd）中进行发酵培养,结果表明,与未含突变基因菌株相比,各含突变基因菌株的胞苷积累量均有不同程度的提高,说明ATCase定点突变使胞苷的合成积累途径得到了不同程度的强化．     

一个野生质粒赋予的抗生素多抗性的遗传分析与鉴定

一株分离自椰子果面的、在LA培养基上产紫色水不溶性色素的野生细菌对安苄青霉素、卡那霉素、潮霉素表现出强烈的抗性。质粒与总DNA的比较分析表明该野生细菌极可能携带一个具有抗生素多抗性的质粒。差异表达显示该质粒能够为抗生素强烈地诱导表达。该质粒的RFLP分析证明这株野生细菌多抗药性确实来自质粒，且该多抗质粒有7个EcoRI酶切位点和5个HindⅢ酶切位点。该质粒电转化大肠杆菌(E．coli)JM109获得9株对安苄青霉素、卡那霉素、潮霉素皆有抗性的转化子，并从转化子中抽提到该抗性质粒，这就更进一步证明该野生细菌对抗生素的多抗性确实来自同一个质粒。     

大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径的改造及其对工程菌L-组氨酸产量的影响

改造大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径,以提高L-组氨酸的产量．用NTG诱变大肠杆菌M-17（SG^r）,依次赋予其2噻唑丙氨酸（2-TA）和组氨酸氧肟酸盐（HisHx）遗传标记,再以突变株M-18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）基因组为模板,扩增组氨酸操纵子基因,构建出重组质粒pUC118-his—operon,将重组质粒导入突变株M—18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）得到工程菌Ecoli M-19（SG^r＋2．TA^r＋HisHx^r／pUC118-his—operon）．根据硝和prs基因序列分别合成引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pSTV28连接,构建重组质粒pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs,将重组质粒分别转化至工程菌E．coli MZH-19,摇瓶发酵测定重组工程菌L-组氨酸的产量．摇瓶发酵结果显示,L-组氨酸产量与对照株相比,工程菌E．coli M-19提高了4．5倍,双质粒系统重组工程菌E．coli MZH-19、Ecoli MPH-19和E．coil MZPH-19分别提高了5．14、5．78、8．43倍．     

过量表达苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌合成L–异亮氨酸的影响

考察过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌发酵生产L-异亮氨酸的影响.将解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶基因ilvA（F383V）连接大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19,过量表达于L-异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum YILW.经5 L发酵罐分批补料发酵产酸实验,与出发菌株C.glutamicum YILW相比,耗糖高峰期滞后,L-异亮氨酸产量增加了10.3%,副产物L-蛋氨酸、L-赖氨酸含量分别降低了33.3%2、6.5%,发酵液中没有L-苏氨酸的累积,乳酸的累积量增加了41.7%.对发酵稳定期的代谢流分布研究表明,过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶使HMP途径流量增加了31.7%,L-异亮氨酸生物合成途径的代谢流提高了8.5%.     

生孢噬纤维菌CMcase基因的分离与表达

从生孢噬纤维菌中分离完整的基因组DNA,经过PstI限制性内切酶部分酶切后,在T4DNA连接酶作用下,将酶切的片段连接到载体pUC18的PstI位点中,然后转化到E.coli DH5α中,构建了基因组文库,经过筛选获得4.2x103个重组子。经过刚果红平板筛选获得了含有CMCase基因片段的重组子,在E.coli中进行表达,E.coli在37℃培养25~30h,培养液中CMCase活力达到22.8U/mL。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性检测

将PCR扩增的人溶菌酶编码基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,双酶切和测序鉴定表明,重组载体构建正确.电转化毕赤酵母GS115菌株,通过G418筛选获得高拷贝重组菌株后,用甲醇诱导表达;通过SDS-PAGE检测证明上清中有目的蛋白,表达产物与预期大小的人溶菌酶蛋白分子质量15 ku一致,其表达量占分泌总蛋白...     

植酸酶基因在海水小球藻细胞内的表达

为建立海水小球藻外源基因转化系统,使外源植酸酶基因在海水小球藻细胞内获得稳定表达,利用电激法将植酸酶基因与海水小球藻细胞共转化;利用含G418的抗性平板筛选抗性藻株,并对所获得的抗性藻株依次进行PCR检测、Southern杂交分析和植酸酶活性与性质的检测.经过转化处理的微藻细胞在含G418的抗性平板上培养3周后,每个平板有10~30个抗性藻株长出;在这些抗性藻株中,PCR检测的阳性率为40.16%;Southern杂交分析和植酸酶活性检测证明,植酸酶外源基因已经在小球藻细胞中获得正确表达.植酸酶外源基因在海水小球藻细胞内被成功表达.