碱性蛋白酶抑制剂lupI-MSSS原核表达载体的构建及其蛋白表达、纯化

低温碱性金属蛋白酶MP是从菌株YS-80-122中提取纯化的,属于沙雷氏蛋白酶家族,与该家族报道的其他酶的结构类似,在MP基因下游有一抑制剂基因lup I,该抑制剂可以完全抑制蛋白酶MP的活性。在野生型抑制剂基因的基础上,通过定点突变将Lup I的N端增加Met-Ser-Ser-Ser,命名为Lup I-MSSS,通过构建p ET28alup I-MSSS原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳结果表明该蛋白的大小约11 kDa,与预测的蛋白分子量一致。对影响蛋白诱导表达的诱导剂添加时间、诱导温度、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、诱导时间4个因素进行优化,并经初步优化得到了其诱导表达的条件为:接种量2%,诱导剂添加时间3 h,诱导剂IPTG终浓度0.5 mmol/L,诱导温度为37℃,诱导时间为8 h。表达的蛋白依次通过超滤,Superdex 200凝胶过滤层析,Q-Sepharose离子交换层析进行纯化,结果显示目的蛋白纯化倍数为20,比活力为15 720U/mg,活性回收率达60.7%,纯化后的lup I通过高效液相色谱法进行纯度分析,其纯度可达99%以上。     

绿色荧光蛋白的原核表达、纯化与荧光分析

将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入到pET30（a）＋构建pET30-GFP表达载体，将重组载体导入大肠杆菌BL-21中，经IPTG诱导产生His—GFP融合蛋白，融合蛋白主要存在于可溶性上清中。用镍柱亲合纯化His—GFP，分子量大约为32．4kD，与预期值相符。荧光分析表明，His—GFP与野生型GFP荧光激发及发射波长基本相同，荧光性质稳定，比常用的荧光素（FITC）具有更强的抗荧光淬灭能力。通过此方法制备的绿色荧光蛋白可用于食用色素的开发等。     

凋亡蛋白质的原核表达与纯化

目的构建来自鸡贫血病毒（CAV,chicken anaemia virus）VP3基因编码的凋亡蛋白质表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并研究凋亡蛋白质的纯化和稳定性。方法PCR（polymerase chain reaction）获得正确编码VP3基因片断,构建表达质粒pET-28a-VP3在E．coli BL21（DE3）中表达。用Ni—NTA柱纯化可溶性目标蛋白质,并研究不同条件下凋亡蛋白质的稳定性。结果目标蛋白质在大肠杆菌中获得表达,纯化后蛋白质纯度高于90％,卡拉胶可明显提高重组蛋白质可溶状态下的稳定性。结论成功获得高纯度VP3可溶性蛋白质,增加了目标产物的稳定性,为进一步研究该蛋白质的临床应用奠定基础。     

重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件的优化

目的：优化重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件,提高具有生物活性的重组蛋白LuxS的表达量,为体外合成自诱导物2（autoinducer-2,AI-2）奠定基础。方法：采用单因素试验,优化诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）的浓度;采用Ni-NTAPurification System对重组蛋白进行纯化,比较Native Elution Buffer的咪唑浓度和pH值对重组蛋白纯化的影响,确定最佳的Native Elution Buffer;对比蛋白与树脂结合时不同缓冲液的纯化效果,选择最优的结合缓冲液。结果：重组蛋白的最佳诱导表达条件为：以LB培养基为诱导培养基,菌液OD600 nm为0.6～0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导温度为37 ℃,诱导时间为12 h。采用添加3 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液,含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作为蛋白洗脱液。使用分离获得的LuxS蛋白合成的AI-2生物活性约为阳性对照的6 倍。结论：本研究成功优化了重组蛋白LuxS的诱导表达及纯化条件,获得了具有生物活性的重组蛋白,并成功合成了AI-2。     

单核细胞增生李斯特菌ladR基因在两种原核表达载体中的克隆表达及纯化分析

利用特异性引物扩增ladR基因序列,分别构建单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ladR基因的两种原核表达载体,即含有6个His标签的pET-28a-ladR表达载体和含有GST标签的pGEX-4T-ladR表达载体。通过诱导时间、温度和浓度优化两种表达载体的蛋白表达条件,比较分析两种表达载体的LadR蛋白可溶性表达水平,利用Western-Blot进行LadR蛋白表达验证。本研究成功构建了pET-28a-ladR和pGEX-4T-ladR表达载体,在大肠杆菌BL21中分别表达出His-LadR和GST-LadR融合蛋白。通过凝血酶切除GST标签,纯化后得到LadR蛋白。在最佳表达条件IPTG为0.5 mmol/L,22 ℃诱导过夜下,pGEX-4T-ladR表达载体中LadR的表达量比pET-28a-ladR（IPTG为1.0 mmol/L,22 ℃诱导过夜）中His-LadR蛋白的表达量高4.48倍。本研究结果表明,GST标签有利于ladR基因的可溶性表达,为后续的LadR蛋白的功能分析和转录调控机理研究奠定了良好基础。     

草鱼潜在过敏原α-烯醇化酶原核表达条件的优化

目的 通过对草鱼α-烯醇化酶(α-Enolase)原核表达的条件进行优化,分别从表达的上清液与包涵体中纯化获得重组α-Enolase。方法 本研究基于前期克隆的草鱼α-Enolase基因序列设计表达引物,将草鱼α-Enolase基因克隆至pET-30a质粒中,得到pET-30a-α-Enolase重组质粒。然后,将重组质粒转入大肠杆菌Origami2(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)进行体外诱导表达。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳方法分析重组蛋白的可溶性,并对表达条件进行优化。利用亲合层析法纯化目的蛋白。结果 在20℃诱导15 h得到的重组蛋白以两种形式存在:一部分为可溶性蛋白存在于上清液中,一部分以包涵体形式存在于沉淀中;在37℃诱导4h得到的重组蛋白则只有包涵体形式。包涵体蛋白表达量最大的优化条件为:诱导温度为37℃, IPTG终浓度1.0 mmol/L,诱导时间4 h。采用亲合层析法分别纯化上清液(20℃诱导15 h)和包涵体中(37℃诱导4 h)的重组蛋白,得率分别为3...     

新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原的重组表达及其单克隆抗体的制备

目的 制备新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白重组抗原及其单克隆抗体。方法 根据公布的新冠病毒全基因组序列,构建其核衣壳蛋白的表达载体pET-28a-N, 并转化至E. coil BL21(DE3)进行原核表达, ELISA及Western blot鉴定纯化后的核衣壳蛋白重组抗原的特异性并免疫Balb/c系小鼠, 基于杂交瘤融合技术筛选获得可持续分泌新冠病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的细胞株, 并基于ELISA及生物膜层干涉技术鉴定单克隆抗体的特异性和亲和力。结果 基于大肠杆菌原核表达获得新冠病毒核衣壳蛋白的重组抗原, 其纯度大于90%, 筛选获得7株可分泌特异性结合新冠病毒核衣壳蛋白的杂交瘤细胞株, 经Western blot、ELISA及分子相互作用分析等方法证实所获得的单克隆抗体与核衣壳蛋白具有优良的结合特异性和结合活性, 其中的7E11、7E8单克隆抗体与核衣壳蛋白抗原的亲和力常数分别为1.69×10-9、2.031×10-9M, 可作为抗体元件应用于新冠病毒的快速免疫分析领域。结论 获得高特异性的新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白重组抗原及其单克隆抗体。     

重组谷氨酸脱羧酶的表达条件优化、纯化及酶学性质研究

为了利用从γ-氨基丁酸（GABA）高产菌株——短乳杆菌Lactobacillus brevis CGMCCNO.1306中克隆并表达的谷氨酸脱羧酶进行GABA的生物制备,研究了影响重组工程菌E.coliBL21（pET28α（＋）-gad）生长的培养基组成和攸关GAD表达水平的诱导条件,优化了这些关键因素,提高了重组GAD的表达水平。采用Ni-NTA亲和纯化方法实现了对所得重组GAD的纯化,获得了纯酶,并确定了重组GAD产生GABA的最适pH值和温度,为该酶的工业应用创造了条件。     

乳酸片球菌素PA-1在大肠杆菌中的表达与纯化

为了实现该细菌素的外源表达,本实验首先利用聚合酶链式反应从乳酸片球菌PAF中扩增出乳酸片球菌素PA-1的结构和免疫基因,然后克隆到表达载体pGEX-6p-1,构建了N端含有GST-His-DDDDK标签的重组质粒pGEX/his-pedAB,然后转化进入大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,重组乳酸片球菌素PA-1在大肠杆菌胞内成功表达。表达的融合蛋白先经过镍亲合层析柱纯化,然后注入谷胱甘肽S-转移酶亲和色谱柱用肠激酶处理,释放出成熟的乳酸片球菌素PA-1。利用高效液相色谱和质谱技术检测乳酸片球菌素PA-1纯度。以单核细胞增生李斯特氏菌CMCC54004为指示菌,利用琼脂扩散法检验乳酸片球菌素PA-1活性。结果表明,携带GST-His-DDDDK标签的融合蛋白无活性,标签切除后其抑菌活性恢复,且其纯度达90%以上。     

原核表达抗克伦特罗重组单链抗体及其纯化研究

目的:原核表达抗克伦特罗重组单链抗体,对表达的包涵体蛋白进行提取和纯化,并鏊定重组抗体特性.方法:通过温度诱导大肠杆菌表达抗克伦特罗单链抗体,超声破碎菌体细胞,采用不同洗涤溶液提取包涵体.以不同变性剂溶解包涵体,Ni-NTA亲和柱纯化后,经脉冲稀释法将其复性.超滤及透析浓缩蛋白复性液,经Ni-NTA亲和柱二次纯化,得到纯化重组目的蛋白.通过SDS-PAGE电泳分析重组目的蛋白纯度,采用Western bloning和间接竞争EUSA对所制备的抗克伦特罗重组单链抗体特异性进行鉴定.结果:以大肠杆菌Es-cherichia coli BL21(DE3)为宿主菌诱导表达重组单链抗体,产率最高,占菌体蛋白的31%.以1 mol/L尿素洗涤包涵体,6 mol/L盐酸胍为变性剂,经Ni-NTA亲和柱纯化,所得复性重组单链抗体蛋白的纯度达96%.Western blotting分析显示,纯化并复性后的单链抗体可与鼠抗His标签蛋白单克隆抗体发生特异性的结合反应.间接竞争ELSIA结果表明,该重组抗体IC50值为3.35 ng/mL,与沙丁胺醇等结构类似物无交叉反应.结论:原核表达制备的抗克伦特罗重组单链抗体具有较好的抗原结合活性及特异性,为进一步开展克伦特罗的免疫快速检测研究奠定基础.     

鲫鱼MBSP的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

构建鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)的原核表达菌株Rosetta(pET28aMBSP),获得重组MBSP,以制备MBSP多克隆抗体。将鲫鱼MBSP全长基因(MBSP)借助表达载体pET-28a构建重组表达菌株Rosetta(pET28a-MBSP),并进行诱导表达后获得重组MBSP。利用Ni-NTA agarose亲和层析柱纯化重组蛋白并进行质谱鉴定。以纯化后的重组MBSP作为抗原免疫新西兰兔,获得MBSP多克隆抗体。分别采用ELISA和Western blot技术测定其效价和特异性。诱导表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析、Western blot检测及质谱鉴定,结果表明该蛋白质为重组MBSP,其相对分子质量约为28×10~3,与天然MBSP大小一致,主要以包涵体形式存在。将其免疫兔子后,从血清中获得了与MBSP发生特异性反应的高效价多克隆抗体。本研究中成功表达和纯化了重组MBSP蛋白,制备了高效价的特异性MBSP多克隆抗体,为MBSP的相关研究奠定基础。     

双孢蘑菇中AbbHLH的表达、纯化及多克隆抗体制备

碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）转录因子在真核生物中广泛存在,是数量较多的转录因子家族之一。该文首次克隆并鉴定双孢蘑菇中的一个AbbHLH（Agaricus bisporus basic helix-loop-helix）转录因子,建立原核表达载体pET-28a（+）-AbbHLH并将其转至E.coli BL21（DE3）感受态细胞中诱导表达,得到主要以包涵体形式存在的6×His-AbbHLH重组蛋白,经纯化与复性后得到纯度超过80%的抗原蛋白。用制备的抗原蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接酶联免疫吸附测定法测定结果表明抗体血清的效价可达102 400。将抗体血清依次经Protein A及CNBr亲和纯化后,用Western Blotting检测抗体特异性,结果表明该抗体能够特异性识别双孢蘑菇中的AbbHLH蛋白。     

莱茵衣藻IFT25的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

IFT25是维持纤毛运动和感知所必须元件纤毛内运输蛋白IFT复合物B中的重要组分之一,探索IFT25尤其在模式生物莱茵衣藻中的作用机制具有重要作用。作者采用经济和简单的方法,制备莱茵衣藻IFT25的兔源多克隆抗体。将ift25分别连接到pMAL-c2X-和pET-28a(+)-载体上,转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导大量表达,并经亲和纯化后蛋白质纯度超过90%。通过颈背部皮下多次免疫8周龄大的新西兰大白兔,制备多克隆抗体,取第五次免疫后血清用ELISA测定效价超过128 000。抗血清依次经过Protein A和硝酸纤维素膜纯化后,用Western blotting检测抗体特异性,结果表明制备的抗体可以特异性识别莱茵衣藻中的IFT25,为IFT25作用机制的阐明和纤毛相关疾病的诊断提供了重要理论和方法支持。     

原核表达重组牛凝乳酶的纯化

原核表达获得的重组牛凝乳酶与商品重组牛凝乳酶有相似的酶学特性,具商业潜力,故进一步研究其纯化方法。使用离心与饱和硫酸铵沉淀,成功纯化出有活性的重组牛凝乳酶。蛋白最终回收率为1.82%,总活力比纯化前提高了73.3%,比活力提高了95.3倍。同时,讨论了如何提高包涵体复性率与产物回收率,为今后该酶的工业化生产提供技术参考。     

Mincle受体蛋白克隆、原核表达与纯化

本研究通过应用基因工程技术,构建融合基因pET14b-Mincle的原核表达载体,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白Mincle,并对其表达产物进行纯化、鉴定、透析复性。采用RT-PCR技术扩增小鼠Mincle的基因片段,将其克隆于载体pMD18-T中,并克隆到带有His-tag的原核表达载体pET14b中;重组质粒经酶切鉴定、序列比对验证正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达目的蛋白。经1mmol/LIPTG在37℃下诱导5h获得了分子量约为22kDa的重组融合蛋白的优化表达,SDS-PAGE、Western Blot和ELISA证实了重组蛋白的特异性。Mincle以包涵体形式在宿主中表达,利用Ni2+亲和柱进行纯化和生物膜透析复性,纯化和透析后的蛋白经WesternBlot、ELISA法定性鉴别以及用白色念珠菌(SC5314)整个灭活细胞对复性后蛋白的活性测定,透析后的Mincle重组融合蛋白能与白色念珠菌的特异性结合体现其生物活性,表明获得了具有活性的蛋白,为后续研究打下基础。     

人源重链铁蛋白纯化及其纳米粒制备

为探究可逆自组装活性纳米笼形铁蛋白的成熟高效制备技术,以构建的人源重链铁蛋白(recombinant human H-chain ferritin,rHuHF)大肠杆菌原核表达系统(BL21-pET3a-rHuHF)为对象,在发酵罐内进行高效表达,并对搅拌转速、空气通量及诱导表达时间3个关键工艺参数进行优化。采用透射电子显微镜和动静态光散射仪对rHuHF的纳米结构及粒径进行表征。结果显示:搅拌转速200 r/min、空气通量1.6 L/min、表达时间9 h为最佳表达条件。经鉴定,铁蛋白存在于菌体胞内可溶物部分且具有良好的自组装活性和单分散笼形结构,9次实验中表达量最高达290 mg/L,明显高于相同条件下摇瓶培养的表达量;pH 7时rHuHF粒径为(11.23±0.10)nm,pH 2时rHuHF粒径为(2.73±0.10)nm。本实验可对铁蛋白在纳米靶向递送系统中的应用等工作提供一定的科学依据。     

Nanog蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及发酵优化

为高效制备可溶性人源Nanog蛋白,降低Nanog蛋白的使用成本。该研究通过分子克隆技术构建重组大肠杆菌(pET32a-Nanog),利用IPTG诱导进行可溶性融合表达。采用镍离子柱亲和层析法纯化产物并将纯化后产物进行肠激酶酶切后得到目的蛋白,Western blot鉴定该蛋白抗体结合的特异性并进一步优化发酵条件。结果表明,原核表达载体pET32a-Nanog构建成功,可在大肠杆菌中与硫氧还蛋白融合表达,融合蛋白经肠激酶酶切后得到相对分子质量约为38 kDa的蛋白,Western blot鉴定该蛋白可与Nanog抗体特异性结合。在摇瓶培养条件下,得到最优发酵条件是诱导温度37℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、甘油为补料碳源;15 L发酵罐上进一步优化溶氧条件及温度控制方式,最终在溶氧设置在30%条件下,37℃(诱导期间30℃维持30 min)发酵12 h后得到最高Nanog产量1 386.4 mg/L,经蛋白纯化后纯度达到90%,为后续Nanog多克隆抗体的制备和基础医学实验研究奠定了基础。     

莱茵衣藻BBSome蛋白BBS2原核表达、纯化和多克隆抗体的制备及鉴定

BBSome蛋白复合物是纤毛蛋白组分之一,BBSome组装或纤毛运输缺陷可导致巴-比二氏综合征。其中,BBSome组分BBS2缺失已被临床证明是导致BBS的病因之一。莱茵衣藻是研究BBSome组装和纤毛运输的一种很好的模式生物。为深入研究BBS2的致病机制,需要特异性识别其BBS2蛋白的抗体。本文将莱茵衣藻BBS2 基因5''端399 bp的cDNA序列克隆到原核表达载体pET28a-bbs2,转入大肠杆菌 BL21（DE3）细胞进行诱导表达。在8 mol/L尿素存在的情况下对该融合蛋白进行镍柱亲和纯化,并将纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔。SDS-PAGE电泳结果表明：分子量为15 kDa的重组6×His-BBS2融合蛋白为水不溶性蛋白。5次免疫后的抗莱茵衣藻BBS2抗血清效价高达1∶256 000。经Protein A琼脂糖CL-4B亲和纯化后的抗血清不仅在Western blotting 分析中能特异性识别莱茵衣藻BBS2,而且在免疫荧光染色分析中能精确定位BBS2于基体和纤毛内。这一多克隆抗体的成功制备为深入开展 BBS2在BBSome组装和纤毛运输中的分子作用机制提供了基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素SEK的纯化及DAS-ELISA检测方法的建立与应用

本研究目的为建立一种快速检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEK的双抗夹心酶联免疫吸附方法。将构建的原核表达载体pET-28a(+)-ΔNspSEK转化入BL 21(DE3)pLysS细胞中诱导表达,经Ni~(2+)-NTA亲和层析柱纯化获得重组SEK蛋白作为抗原。利用双抗夹心酶联免疫方法检测程序,确定抗SEK单克隆抗体及抗SEK多克隆血清的最佳稀释度,并使用该方法应用于检测SEK人工污染样品的加标回收率和茶多酚及乳酸链球菌素(Nisin)对7株sek阳性菌株的SEK蛋白分泌影响。结果表明,原核表达载体得到可溶性表达,重组SEK蛋白分子量约为27.7ku;建立的双抗夹心酶联免疫检测方法中,单克隆抗体最佳包被浓度为2.89μg/mL、抗血清的最佳稀释度为1:500,回归方程为y=0.2165x+0.1627,相关系数R~2=0.9993,最低检测限为0.1μg/mL;检测SEK人工污染脱脂奶、LB肉汤和牛肉糜中的加标回收率高达97%以上;并且,采用建立的方法测得茶多酚和Nisin的添加浓度在其MIC及以下浓度时,茶多酚对7株sek阳性菌株蛋白分泌抑制效果更明显。     

凋亡蛋白质的原核表达与纯化

目的 构建来自鸡贫血病毒(CAV,chicken anaemia virus) VP3基因编码的凋亡蛋白质表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并研究凋亡蛋白质的纯化和稳定性.方法 PCR(polymerase chain reaction)获得正确编码VP3基因片断,构建表达质粒pET-28a-VP3在E.coli BL21(DE3)中表达.用Ni-NTA柱纯化可溶性目标蛋白质,并研究不同条件下凋亡蛋白质的稳定性.结果 目标蛋白质在大肠杆菌中获得表达,纯化后蛋白质纯度高于90%,卡拉胶可明显提高重组蛋白质可溶状态下的稳定性.结论 成功获得高纯度VP3可溶性蛋白质,增加了目标产物的稳定性,为进一步研究该蛋白质的临床应用奠定基础.