NDM-1基因PCR检测技术的研究

NDM-1基因是一种"超级细菌"特有的耐药基因,对于菌体的广谱抗药性起着决定性的作用。本研究以实现该基因的快速检测为目的,初步建立了NDM-1基因的PCR快速检测鉴定法。选取肺炎克雷伯氏菌ADB65的NDM-1基因为目的基因,设计并合成了PCR检测引物(ND-319-F和ND-319-R),并以另外11种标准菌株为对照,分别进行了PCR检测。结果表明,携有NDM-1基因的质粒DNA经过PCR反应都扩增出长为319bp的特异性片段,而其他对照病菌均未出现相应片段,证明这对引物具有NDM-1基因检测的特异性。灵敏度测定结果,此体系可检出100fg/μL质粒DNA模板。研究表明,PCR方法是一种特异、灵敏、快速的NDM-1基因检测方法。     

NDM-1基因TaqMAN实时荧光PCR检测方法的建立

研究初步建立了NDM-1基因的实时荧光PCR快速检测鉴定方法。研究根据NDM-1序列,设计并合成了PCR检测引物(ND-T-F和ND-T-R)和探针(ND-T-PROBE),对NDM-1质粒DNA和其他11个标准菌株进行了实时荧光PCR检测。结果表明,携有NDM-1基因的质粒DNA模板都出现了很强的特异信号,而其他对照病菌均未出现特异荧光信号,证明这套引物及探针具有NDM-1基因检测的特异性。灵敏度测定结果,此体系可检出10fg/μL质粒DNA模板。研究表明,TaqMAN实时荧光PCR方法是一种特异、灵敏、快速的NDM-1基因检测方法。     

NDM-1基因新型染料EverGreen实时荧光PCR检测方法的建立

研究初步建立了NDM-1基因的实时荧光PCR快速检测鉴定方法。研究根据超级细菌NDM-1序列,设计并合成了检测引物(ND-E-F和ND-E-R),对NDM-1质粒DNA和其他11个标准菌株进行了EVERGREEN实时荧光PCR检测。结果表明,携有NDM-1基因的质粒DNA模板都出现了很强的特异信号,而其他对照病菌均未出现特异荧光信号,证明这套引物及探针具有NDM-1基因检测的特异性。灵敏度测定结果,此体系可检出10fg/μL质粒DNA模板。研究表明,EverGreen实时荧光PCR方法是一种特异、灵敏、快速的NDM-1基因检测方法。     

基于HDA的超级细菌耐药基因NDM-1检测方法的建立

本研究以建立解旋酶DNA恒温扩增(HDA)检测方法为目的,选择三种超级细菌NDM-1基因(metallo-beta-lactamase 1 gene)为目的基因,设计并合成特异性引物,建立和优化了可快速检测该种基因的HDA检测方法。特异性和灵敏度检测结果表明:该方法对NDM-1基因检测具有特异性,最低检测限可达10fg/μL,灵敏度高于普通PCR。提示HDA是一种针对NDM-1的快速、灵敏、便捷的非PCR核酸扩增技术。     

超级细菌NDM-1基因高通量微球悬浮芯片检测方法的建立

本研究以建立微球体悬浮芯片检测方法为目的,选择三种超级细菌NDM-1基因(metallo-beta-lactamase 1 gene)为目的基因,设计并合成标记特异性探针,与荧光编码微球偶联后与细菌NDM-1基因的PCR产物杂交反应,用微球悬浮芯片检测仪检测荧光信号,建立可快速检测该种基因的微球体悬浮芯片检测方法。特异性和灵敏度检测结果表明:该方法对NDM-1基因检测具有特异性,最低检测限可达10fg/μL,灵敏度高于普通PCR技术,提示微球体悬浮芯片是一种针对NDM-1的快速、灵敏、便捷的新型核酸检测技术。     

利用环介导等温扩增技术检测NDM-1基因的研究初探

以人工合成的NDM-1基因序列为研究材料,在其保守区设计3对4条恒温扩增引物,通过特异性及灵敏度验证实验,初步建立了NDM-1基因的LAMP检测方法。琼脂糖凝胶电泳结果表明,研究中NDM-1基因经过等温扩增后形成了特异性的梯状条带,为食品中潜在超级细菌的现场快速检测提供了一种更加简便快速的方法,可以满足现场检疫的需要。     

双重PCR-DHPLC技术快速检测水产品中金黄色葡萄球菌

根据编码金黄色葡萄球菌肠毒素A的sea基因、编码耐热核酸酶的nuc基因为目的基因,设计两对特异性引物,利用聚合酶链式反应结合变性高效液相色谱技术,建立水产品中金黄色葡萄球菌的双重PCR-DHPLC检测方法。以30株参考菌株进行特异性实验,除所试8株金葡菌出现目的片段和阳性吸收峰外,其余菌株均未检测到目的片段与阳性吸收峰,表明该方法具有良好的特异性。灵敏性实验结果表明,检测灵敏度达到菌液浓度50CFU/mL,比普通的凝胶电泳高一个数量级。利用建立的双重PCR-DHPLC检测方法对240份水产品进行检测,共检出22株金黄色葡萄球菌,检出率为9.2%,其中含有肠毒素基因有8株,占总样本的3.3%,与国标法检出阳性率比较无显著差异,证明该方法具有良好的实用性。实验证明,本研究建立的双重PCR-DHPLC方法不仅可以特异、灵敏、简便快速且高通量的实现对水产品中金葡菌的检测,而且也可通过对肠毒素基因的分析,方便地判断出该菌株致病性的强弱。     

基于RPA-LFD法的多黏菌素耐药基因mcr-1可视化快速检测方法建立与应用

目的：建立一种快速、高效、可视化的细菌多黏菌素耐药基因mcr-1检测方法,为其基层检测的展开提供依据和便利。方法：利用重组酶聚合酶扩增结合胶体金侧向流试纸条技术(Recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick,RPA-LFD),辅以手持式胶体金读数仪;根据mcr-1基因保守序列设计合成一对特异性RPA引物,通过对反应条件和体系的优化,以及特异性试验、灵敏度试验、模拟食样试验和实际样品试验,成功建立了可视化定量检测细菌多黏菌素耐药基因mcr-1的RPA-LFD方法。结果：在引物浓度400 nmol/L,引物比例1:1时,该方法最佳反应条件为Mg²⁺浓度14.0 mmol/L,反应温度37℃,反应时间20 min;灵敏度好,标准曲线方程为y=0.117x+0.051,定量限为10¹～10⁸ copies/μL,检出限为10¹ copies/μL,比PCR法低一个数量级且模拟样品检出结果与PCR法一致。利...     

食源性致病菌通用型多重荧光PCR快速检测体系的建立

以两种食源性致病菌(沙门氏菌、单增李斯特菌)为模板,对通用型多重荧光PCR快速检测体系进行了研究。建立的通用型多重荧光PCR反应体系为:25μL反应液中,Tris-HCl为50mmol/L、pH值为8.8、KCl15mmol/L、(NH4)2SO4为8mmol/L、Mg2+为3mmol/L、dNTP为1.0mmol/L、引物和探针的终浓度分别为1μmol/L和0.5μmol/L、加入0.5μLDMSO,2.5U/份的Taq酶与等量的Taq酶抗体。     

饲料中黄曲霉毒素B1快速检测方法的研究

取２０ｇ被检样品,在３６０ｎｍ紫外线下观察,如无亮黄绿色荧光粒,可基本判定饲料未受黄曲霉毒素Ｂ１污染;如有１￣４个亮黄绿色荧光粒,可疑为饲料黄曲霉毒素Ｂ１污染;如有４个以上黄绿色荧光粒,可判定饲料受到了黄曲霉毒素Ｂ１污染。     

胶体金免疫层析法检测酱油中黄曲霉毒素B1

采用胶体金免疫层析法检测酱油中的黄曲霉毒素B1。加标的酱油样品经提取后,以胶体金免疫层析法对其进行黄曲霉毒素B1测定,并与酶联免疫吸附法进行比较。结果表明,当酱油中黄曲霉毒素含量超过国家限量标准(5μg/kg),胶体金免疫层析法检测结果为阳性,说明该方法能够满足酱油样品中黄曲霉毒素B1监控的要求。     

干酪中含氮物的快速测定方法

综述了各种快速测定干酪中含氮物的方法，包括凯氏法，紫外光谱法，Lowry法，染料结合法，赤藓红法，茚三酮法，三硝基苯磺酸法，邻苯二甲醛法，荧光胺法。并对它们的适用范围、研究与使用状况进行评述。     

Rapid assay for limonin using a new selective detecting system for limonoids

A rapid procedure is described for the direct assay of limonin which makes use of a new detecting system and a new solvent system for thin-layer chromatography (t.l.c.) of limonoids. The detecting system, which involves exposure to bromine vapour and spraying with Tollens' reagent, is more selective and sensitive than previous methods, detecting five limonoids in orange juice extracts, whereas previous t.l.c. procedures only gave one spot.     

A rapid assay for detecting sulfonamides in tissues of slaughtered animals

Governments regulate antimicrobial residues in slaughtered animals with surveillance programs for detecting drugs in food-producing animals. Although initial screening bioassay systems are recognized for their sensitivities to antimicrobial drug groups, none are sensitive to sulfonamides at or near the maximum residue levels (MRLs) in the Codex Alimentarious. We have developed a sulfonamide-sensitive rapid assay using Bacillus stearothermophilus inoculated PM indicator agar containing bromcresol purple and trimethoprim, where the end point is a combination of color change in the agar and zone of microbial growth inhibition around the sampling disk. Five sulfonamides, plus 16 other antimicrobial drugs were tested in standard concentrations in water, bovine kidney, and ground beef. Sulfonamides were detected at concentrations near the MRLs, and they were presumptively identified using para-aminobenzoic acid. The rapid assay was extremely sensitive to beta-lactams that were presumptively identified using penase. The system also was sensitive to tetracyclines, aminoglycosides, and macrolides, of which tetracyclines and gentamicin were identified using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In trials on slaughterhouse tissues submitted for testing in Ontario's meat surveillance program, the rapid assay identified twofold the number of positive kidneys and threefold the number of positive diaphragm samples compared to a standard microbiological inhibition test (MIT) currently approved. Fifty-three of 471 carcasses were sulfonamide positive with the rapid assay, while no sulfonamides were detected with the MIT. ELISA and thin-layer chromatography were used on selected samples to confirm the rapid assay sulfonamide presumptive results.