2013～2016年A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗质量的一致性分析

目的分析2013~2016年本公司生产的A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗关键质量属性的变化趋势,评价产品质量的一致性。方法根据《中国药典》三部(2010及2015版)规定的方法对2013~2016年本公司生产的520批A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗的多糖含量(A群磷含量、C群多糖N-乙酰神经氨酸含量)、水分及多糖分子大小等关键质量指标进行检测,应用Minitab数据分析软件对产品关键质量指标的检测结果进行I-MR控制图趋势比较分析、方差分析及工艺能力指数分析。结果 2013~2016年A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗的A群磷含量、C群多糖N-乙酰神经氨酸含量、水分及多糖分子大小的检测结果均在国家标准范围内,整体处于稳定状态。结论 A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗生产工艺稳定,产品质量一致性良好。     

脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中A群游离多糖含量测定方法的建立

目的建立脑膜炎球菌结合疫苗中A群游离多糖含量的定量检测方法,并进行验证。方法采用高效阴离子色谱-电导法(high-performance anion-exchange chromatography with conductivity detection,HPAEC-CD),分析柱:IonPacTMAS11 Analytical(4 mm×250 mm),22 mmol/L Na OH流洗,流速为1 ml/min,25μl自动进样,电导检测。筛选样品的氧化反应最佳温度、双氧水浓度及干烤时间,确定HPAEC-CD的检测限和定量限,并进行专属性、准确性及精密度验证。应用建立的方法检测3批多糖蛋白结合物原液A-破伤风类毒素(A-tetanus toxoid,A-TT)多糖及游离多糖含量,并与《中国药典》三部(2010版)附录ⅦA磷测定法中的传统比色法进行比较;同时检测3批A、C群及A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗的多糖及游离多糖含量。结果确定样品的氧化条件为:100μl/ml H2O2,220℃干烤90 min。磷标准品在0.1~1μg/ml范围内,峰面积和浓度线性关系良好(r=0.999 877);TT、C-TT、W-TT及Y-TT对测定无干扰;该方法的检测限为0.007μg/ml,定量限为0.024μg/ml;A群脑膜炎球菌多糖原液的加样回收率在97.56%~102.95%之间;重复性及不同操作者间的精密度试验结果 RSD均小于5%。A-TT的多糖含量及游离多糖含量与传统比色法测定结果差异较小;3批A、C群及A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗的多糖含量均符合《A、C群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程草案》及《A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程草案》要求,游离多糖含量分别为24.31%、23.04%、24.44%和19.07%、17.80%、19.46%。结论采用H2O2氧化处理,HPAEC-CD检测,除了能对脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中微量A群多糖含量进行定量检测外,还能够进行游离多糖含量的检测。该方法灵敏度和精密度良好,操作简单、安全,对操作者及环境提供了保护。     

冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的稳定性

目的观察冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗在2~8℃条件下的稳定性。方法将冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗放置在2~8℃条件下,定期取样,检查其物理外观,检测多糖含量、水分含量和分子大小,并进行鉴别试验以及异常毒性和免疫原性试验,考察其稳定性。结果冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗于2~8℃保存30个月,各项质量控制指标仍符合该疫苗企业注册标准。结论冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗在2~8℃条件下,其质量稳定。     

3种磷含量测定方法的比较

目的比较3种A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中磷含量测定方法的差异,为今后方法的选择及进一步优化提供参考。方法对《中国药典》三部(2010版)附录中的磷测定法(方法1)、高分子结合物含量测定法(方法 2)、文献中的磷测定法(方法 3)这3种方法的标准曲线、测定磷酸二氢钾对照品中磷含量、测定A群多糖、A群衍生物、A群结合物中磷含量以及标准曲线增加两个低浓度点的差异进行比较。结果不同人员采用同一方法绘制的标准曲线的斜率(b)的变异系数(CV)均小于10%,相关系数(r2)均在0.995以上,CV值在0~0.23%之间,其中方法 2标准曲线b值的CV值小于1%,且r2值与其他两种方法相比更稳定;3种方法测定同一份磷酸二氢钾对照品的结果与理论值相比,相对误差均在10%以下,其中方法 2的相对误差最小,为5.73%;3种方法测定A群多糖、A群衍生物、A群结合物中磷含量的CV值均小于10%;3种方法的标准曲线增加两个低浓度点后,b值及r2值的CV值均小于10%,与原标准曲线近似。结论 3种方法测定磷含量的标准曲线均具有良好的线性,不同操作人员的测定结果无明显差异,其中方法2测定A群脑膜炎球菌多糖、A群脑膜炎球菌多糖衍生物及A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中的磷含量时,稳定性较好,操作简便易行。     

A群脑膜炎球菌多糖结合物原液中游离糖含量测定方法的建立及其验证

目的建立A群脑膜炎球菌多糖结合物原液中游离糖含量测定的方法,并进行验证。方法采用脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,DOC)法,分别取1 ml 10、50、100、150、200、250、294μg/ml载体蛋白破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT),与100μl 1%DOC溶液(pH 7.3)混匀,离心收集上清,检测蛋白含量,确定DOC沉淀载体蛋白范围;用不同离子强度梯度的缓冲液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L氯化钠)稀释游离多糖与载体蛋白混合物溶液,收集上清,检测多糖含量,确定游离多糖分离条件;以1%DOC溶液作为稀释剂绘制参考品磷含量测定标准曲线,确定DOC存在对磷含量测定结果的影响,建立DOC沉淀蛋白结合磷含量测定方法测定A群脑膜炎球菌多糖结合物中游离糖含量的方法,并对建立的方法进行精密度、准确性及重复性验证。结果 DOC沉淀载体蛋白浓度控制在250μg/ml以下;将0.8 mol/L氯化钠溶液作为A群脑膜炎球菌多糖结合物中游离糖含量测定所需最佳稀释液;以1%DOC溶液作为稀释剂绘制的磷含量标准曲线线性范围在0~4μg/ml时,r2为0.999 9。A群脑膜炎球菌多糖结合物原液及游离糖对照品与载体蛋白混合物沉淀中蛋白回收率在95%~110%之间;游离糖添加试验回收率均在95%以上;4批A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物游离糖含量平均值均在规定范围内。结论建立的DOC沉淀蛋白结合磷含量测定方法可有效分离结合物与游离多糖,并准确测定结合物含量。     

A群流行性脑膜炎球菌多糖含量检测免疫速率比浊方法的建立及验证

目的应用免疫速率比浊方法测定A群流行性脑膜炎球菌多糖含量,并进行验证。方法采用免疫速率比浊方法测定A群脑膜炎球菌多糖标准品多糖含量,绘制标准曲线,对该方法的精密性、准确性、灵敏性进行验证,并进行干扰试验。结果多糖抗原浓度在0~10μg/ml之间,与相应的浊度值呈良好的线性关系,R2=0.984 3;该方法检测结果的日内和日间CV值均小于5%,不同浓度A-DT结合物样品的回收率在99.67%~102.00%之间,最低检出限为0.159μg/ml;加入C群流行性脑膜炎球菌多糖后的A群脑膜炎球菌多糖含量与未添加相比,差异无统计学意义(P0.05)。结论免疫速率比浊方法测定A群脑膜炎球菌多糖含量具有较高的准确度、精确度及灵敏度,并具有较强的特异性。     

紫外-分光光度法测定A群脑膜炎球菌多糖含量的不确定度评估

目的对紫外-可见分光光度法测定A群脑膜炎球菌多糖含量的不确定度进行评估。方法根据测量过程,分析评估A群脑膜炎球菌多糖含量测定过程中的不确定度来源,计算各分量的不确定度,建立数学模型,计算出合成标准不确定度uc和扩展不确定度U。结果 A群脑膜炎球菌多糖含量测定的合成标准不确定度uc和扩展不确定度U分别为21和42μg/ml(k=2)。结论磷标准溶液的配制稀释是影响紫外-可见分光光度法测定A群脑膜炎球菌多糖含量不确定度的主要因素,可从此处着手改善方法。     

ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量火箭电泳检测方法的建立及其验证

目的建立ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量检测的火箭电泳法,并对该方法进行验证。方法分别用A、C、Y、W135群菌液免疫家兔,制备特异性抗血清,加至琼脂糖凝胶平板中,以定量的各群多糖原液作为抗原参考品进行火箭电泳,用已知的多糖浓度及对应的火箭峰高绘制标准曲线,得出直线回归方程,根据样品的火箭峰高计算多糖含量,确定该方法的检测限,并对该方法进行专属性、线性重复性、准确度、精密度验证;用建立的方法检测3批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量。结果根据该方法绘制的标准曲线呈良好的线性关系,R2均≥0.95;该方法确定样品多糖浓度检测范围为3~7μg/ml,回收率在90%~110%范围内;重复性及不同操作者间的精密度试验结果 RSD均小于5%;特异性好,未检出各群抗原之间的交叉反应。3批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量均符合企业内部《ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗制造与检定规程》的要求。结论建立的火箭电泳方法可用来检测ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的多糖含量。     

冻干A、C、W_(135)、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗的稳定性

目的观察冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗在2～8℃保存的稳定性。方法将冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗放置在2～8℃条件下30个月,定期取样,观察其物理外观,进行鉴别试验,并测定多糖含量、分子大小、水分含量、异常毒性等质量控制指标,评价疫苗质量的稳定性。结果冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗于2～8℃30个月保存,各项质量控制指标仍符合该疫苗企业注册标准。结论冻干A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖疫苗在2～8℃保存,其质量稳定。     

1-氰基-4-二甲基氨基吡啶·四氟化硼活化A群脑膜炎球菌多糖制备的结合疫苗的免疫原性及其工艺稳定性

目的分析1-氰基-4-二甲基氨基吡啶·四氟化硼(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化A群脑膜炎球菌多糖(group A meningococcal polysaccharide,Men APS)制备的A群脑膜炎球菌结合疫苗的免疫原性及其工艺稳定性。方法用CDAP活化多糖后,己二酰肼(adipic dihydrazide,ADH)衍化,制备多糖-酰肼基衍生物,在碳二亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopmpyl)carbodiimide,EDAC]作用下,与TT偶联,制备A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液(Men APSCDAP-TT),考察其免疫特性;将Men A PSCDAP-TT与C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液混合,制备A、C群脑膜炎球菌结合疫苗(Men ACPSCDAP-TT),再与市售的采用溴化氰(CNBr)活化多糖制备的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗(Men ACPSCNBr-TT)进行抗A群多糖Ig G抗体水平的比较。连续制备12批结合疫苗原液及9批结合疫苗,原液参考《中国药典》三部(2010版)进行各项检定,疫苗进行抗A群多糖Ig G抗体水平的检测。结果 Men APSCDAP-TT具有T细胞依赖性抗原特性;Men ACPSCDAP-TT免疫2次后产生的抗A群多糖Ig G抗体GMT明显高于市售疫苗免疫2次后水平,差异有统计学意义(P均0.01),也高于或相似于市售疫苗免疫3次后水平,但差异无统计学意义(P均0.05);免疫3次后产生的抗A群多糖Ig G抗体GMT仍高于或相似于市售疫苗,但差异无统计学意义(P0.05)。连续制备的12批结合疫苗原液,内毒素含量均低于10 EU/μg多糖,未检出游离蛋白,多糖/蛋白值、结合多糖含量、结合物分子大小分布、EDAC和ADH残留均符合A群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程(试行)YBS01112006的要求,主要检测指标及多糖回收率趋势分析基本在均数±2标准差内;9批Men ACPSCDAP-TT免疫后产生的抗A群多糖Ig G抗体GMT均在A群脑膜炎球菌多糖的60倍以上。结论经CDAP活化多糖后衍化再与载体蛋白结合制备的A群脑膜炎球菌结合疫苗具有良好的免疫原性,制备工艺稳定、可靠,为规模化生产奠定了基础。     

脑膜炎球菌多糖菌苗Kd值检定法的改进

<正> 脑膜炎球菌多糖菌苗Kd值测定,先用Sepharose4B凝胶层析,用醋酸铵溶液洗脱,然后测定洗脱液中磷含量,再按公式计算出Kd值(下称原法)。该法操作繁杂,费时且耗费多量药品。作者在研究脑膜炎球菌多糖分光特性中发现脑膜炎球菌多糖的醋酸铵及生理盐水洗脱液,分别在紫外光区223nm及206nm处有特异吸收峰。应用不同倍数稀释的多糖在分光分析中OD_(223)、OD_(206)与多糖含量之间,都有很好的正     

高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法测定四价脑膜炎球菌多糖疫苗的多糖含量

目的采用高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法(high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detector,HPAEC-PAD)测定四价脑膜炎球菌多糖疫苗中A、C、Y、W135群多糖含量,并对该方法进行验证。方法用三氟乙酸对四价脑膜炎球菌结合疫苗进行水解,得到各群多糖的水解产物:唾液酸、葡萄糖、半乳糖、6-磷酸葡萄糖胺(ManN-6-P),采用HPAEC-PAD法,CarboPac PA10分离柱分别测定缓冲提取液中的总唾液酸、葡萄糖、半乳糖、ManN-6-P的含量,利用归一化的峰面积计算相应唾液酸系数,再计算C群脑膜炎球菌唾液酸含量。对HPAEC-PAD法进行验证,并与传统火箭电泳法检测结果进行比较。结果四价脑膜炎球菌结合疫苗水解后得到的4群单糖均呈良好线性,分离度和峰形均良好;HPAEC-PAD法检测4群糖的日内和中间精密性的RSD均小于5%;各群多糖峰面积的回收率均在80%¹20%之间;3批四价脑膜炎球菌多糖疫苗水解后,经HPAEC-PAD法测定的各群多糖含量与传统火箭电泳法测定结果相当。结论 HPAEC-PAD法检测四价脑膜炎球菌多糖疫苗中的A、C、Y、W135群多糖含量准确、简便、快速、可靠,对控制该疫苗的质量具有重要意义。     

A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的稳定性

目的　观察A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的稳定性。方法　疫苗放不同温度和不同时间后 ,用乙醇沉淀法测定A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的游离多糖含量 ,SepharoseCL 4B凝胶层析法测定分子大小。结果液体疫苗放置 2～ 8℃ 9个月 ,游离多糖含量为 30 %以上 ;4℃放置 18个月 ,Kd <0 2的多糖回收率 <6 0 %。冻干疫苗放置 2 5℃和 37℃ 12个月 ,或放置 2～ 8℃ 18个月 ,游离多糖含量均不高于 2 5 % ,Kd <0 2的多糖回收率 >6 0 %。结论　冻干A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗具有良好的稳定性。     

接种A群脑膜炎球菌多糖菌苗偶合病毒性脑炎一例

<正> 我们在进行 A 群脑膜炎球菌多糖菌苗接种中出现一例急性病毒性脑炎。现报告如下:患者:女,7岁,于1989年11月21日下午7时许,在左上臂皮下接种 A 群脑膜炎球菌多糖菌苗(长春生物制品研究所产品,批号894-4)0.5ml,于次日下午3时左右出现抽搐,抽搐时头后偏,双眼球右斜视,牙关紧闭,口角抖动,持续20多分钟后自行缓解,伴呕吐两次,为非喷射状胃内容物,并伴有头痛。4小时后又抽搐一次,症状基本同前。     

四价脑膜炎球菌多糖疫苗中结合物多糖抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的建立一种检测A、C、W135和Y群四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群多糖蛋白结合物的双抗体夹心定量ELISA检测方法,并进行验证。方法以白喉类毒素无毒变异体(CRM197)特异性单抗为包被抗体,HRP标记的脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖特异性单抗为捕获抗体,建立可定量检测脑膜炎球菌各血清群结合物多糖含量的双抗体夹心ELISA法,确定方法的最佳线性范围和检测限,并对方法的特异性、准确性和重复性进行验证。结果定量检测A群脑膜炎球菌结合物(GAMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为3.75~120 ng/ml,检测限为3.75 ng/ml;定量检测C群脑膜炎球菌结合物(GCMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~30 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml;定量检测W135群脑膜炎球菌结合物(GWMPCRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为7.5~240 ng/ml,检测限为7.5 ng/ml;定量检测Y群脑膜炎球菌结合物(GYMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~60 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml。A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法均能特异性地检测相应的结合物多糖抗原含量,而不与其他群的结合物多糖抗原发生交叉反应;A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法的回收率均在80%~120%之间,检测相应的结合抗原样品时,变异系数(CV)均小于15%。结论建立的双抗体夹心ELISA法特异性较强,准确性较高,重复性良好,可用于四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群结合物多糖抗原的定量检测。     

AC群脑膜炎球菌与b型流感嗜血杆菌联合疫苗多糖含量免疫速率比浊检测方法的建立及验证

目的建立AC群脑膜炎球菌与b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)联合疫苗(Men AC-Hib)多糖含量免疫速率比浊检测方法,并进行验证。方法采用免疫速率比浊法测定联合疫苗中A群、C群脑膜炎球菌及Hib多糖含量,绘制不同多糖抗原含量的标准曲线,并对方法的检测低限、精密度、准确度和特异性进行验证。结果 3种不同多糖抗原浓度在2~8μg/ml之间具有良好的线性关系,相关系数均大于0.98;建立的方法检测A群、C群脑膜炎球菌和Hib多糖的检测低限分别为0.847、0.043和0.507μg/ml;检测各组分多糖抗原含量的批内和批间变异系数均小于5%,平均回收率在88.30~104.40%之间;各组分特异性多糖抗体仅与各自多糖抗原反应,且各组分多糖抗原共同存在时无相互干扰。结论成功建立了准确、特异的AC群脑膜炎球菌与Hib联合疫苗的多糖含量检测方法。     

A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研制

目的研制A+C群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗。方法A群和C群脑膜炎球菌多糖在溴化氰(CNBr)的活化下,以1,6己二酰肼(ADH)作为连接子,与精制破伤风类毒素(TT)在碳二亚胺(EDAC)作用下结合,再按一定的比例将两者混合,制成A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液,加保护剂冻干后,制成A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。结果经检定,A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗各项指标均达到了质控标准。该疫苗安全性及免疫原性良好。结论已成功研制出冻干A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗,该制备工艺是可行的。     

接种脑膜炎球菌多糖菌苗对其发病率影响的统计学分析

<正> 接种脑膜炎球菌多糖菌苗是控制流行性脑脊髓膜炎(下称流脑)流行的重要措施之一。。我市历年流脑发病率基本呈周期性变化,但从1987年起却呈直线下降,原因是否与接种脑膜炎球菌多糖菌苗有关,作者用回归方法分析,结果如下。 1.资料来源:表1是我市历年的流脑发病率。从1987年起,我市开始在1～14周岁人群中推行脑膜炎球菌多糖菌苗预防     

冰点下降法测定乙型脑炎减毒活疫苗和两种脑膜炎球菌多糖疫苗的渗透压摩尔浓度

目的采用冰点下降法测定乙型脑炎减毒活疫苗、A群脑膜炎球菌多糖疫苗和ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗及相应稀释剂的渗透压摩尔浓度。方法按照《中国药典》三部(2010版)附录渗透压摩尔浓度测定法,采用冰点下降法分别测定市售20批乙型脑炎减毒活疫苗、55批A群脑膜炎球菌多糖疫苗和7批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗及相应稀释剂的渗透压摩尔浓度。结果 3种疫苗之间的渗透压摩尔浓度存在较大的差异,在260~700 m Osmol/kg之间,其中乙型脑炎减毒活疫苗的批间和批次内渗透压摩尔浓度之间的差异较大,A群脑膜炎球菌多糖疫苗和ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗各自的批间和批次内渗透压摩尔浓度差异不大;3种疫苗稀释剂的渗透压摩尔浓度也存在较大差异。结论在上述3种疫苗质量控制体系中应酌情增加渗透压摩尔浓度检查项。     

高效阴离子交换色谱-脉冲安培法测定W135群和Y群脑膜炎球菌多糖中半乳糖和葡萄糖含量

目的采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培法(High-performance anion-exchange chromatography with pulsedamperometric detection,HPAEC-PAD)测定W135群和Y群脑膜炎球菌荚膜多糖中半乳糖和葡萄糖的含量,并对该方法进行验证及初步应用。方法多糖蛋白结合物原液的混合液经HCl水解处理后,进样CarboPac PA10柱,以氢氧化钠-醋酸钠梯度流洗,脉冲积分安培检测器检测。筛选样品的水解条件;对HPAEC-PAD法进行专属性、精密性及准确性验证,并进行初步应用。结果确定的样品水解条件为以2 mol/L HCl于85℃处理1 h。载体蛋白破伤风类毒素对检测结果无干扰;重复性、日内精密性和不同操作者之间精密性试验结果的RSD均小于5%;准确性试验中葡萄糖和半乳糖的回收率在90%～110%之间。HPAEC-PAD法测定多糖蛋白结合物原液的多糖含量与传统间苯二酚比色法测定结果相当;成品疫苗中的W135群和Y群多糖含量测定结果符合《A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程草案》的规定(均≥4μg/剂)。结论 HPAEC-PAD法专属性、精密性和准确性良好,可用于A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗中W135群和Y群多糖含量的测定。