枯草芽孢杆菌基因的安全改良研究

为了构建能稳定表达外源基因且无抗性标记基因的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)工程菌。采用聚合酶链式反应(PCR)技术,分两段扩增定位于B.subtilis BJ3-2染色体上的谷氨酰胺酶基因(glsA)上下游基因片段作为同源臂。将同源臂及卡那霉素基因(Kan)克隆入温敏型载体pKSV7,构建了双交换载体pKUKD。并利用pKUKD质粒将kan基因定点整合入BJ3-2染色体上,通过Kan抗性筛选获得glsA敲除菌株BJ-kan。经检测BJ3-2菌株谷氨酰胺酶活力比重组菌株高3.2倍。结果显示:BJ3-2染色体上的基因可通过同源重组方式进行敲除与置换,为今后BJ3-2菌株以及野生型B.subtilis基因敲除与置换提供了更加便捷的方法。     

生物合成γ-氨基丁酸酿酒酵母谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

为了提高酵母菌的γ-氨基丁酸产量,本研究以十六烷基三甲基溴化铵法(hexadecyl trimethy ammonium bromide,CTAB)提取的酿酒酵母28基因组DNA为模板,扩增得到序列长度为1 758 bp的GAD1基因,经比对与S.cerevisiae S288c的一致性达到98.58%,并设计引物扩增包括GAD1基因上游启动子及调控序列,下游终止子在内的全长基因序列,长度为3 490 bp。将全长基因序列克隆至高拷贝质粒p UG6,构建重组质粒p28。以菌株28作为出发菌株进行转化,经G418抗性筛选得到转化子,进一步经过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)实验验证,质粒提取及酶切验证,确证得到重组子DL28。经重组质粒p28的特性研究得知,重组质粒p28具有良好的遗传稳定性,无抗性传代培养10次重组质粒不丢失。转化后进行酶活力测定,重组子DL28的谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)酶活力比菌株28提高73.8%。通过以上实验结果得出结论,GAD基因高表达菌株DL28具有更高的G418抗性和GAD酶活性。     

适应性进化和改造质粒稳定性促进枯草芽孢杆菌合成N-乙酰神经氨酸

N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,NeuAc)作为营养化学品和药物中间体在保健品和医药领域具有广泛的应用。为了提升重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)合成NeuAc的产量,首先利用NeuAc生物传感器(NeuAc-Biosensor)调控抗生素抗性基因表达,在抗生素存在条件下将细胞生长与NeuAc合成相关联。进而通过增加抗生素浓度进行适应性进化,促进NeuAc合成效率提升。研究结果显示,当利用NeuAc-Biosensor分别调控壮观霉素抗性基因(spc)和红霉素抗性基因(erm)时,高产菌株能够在较高抗生素浓度条件下生长。通过在培养过程中逐步增加抗生素浓度开展适应性进化,结果表明采用壮观霉素和红霉素进行双抗性适应性进化时,进化获得的菌株中假阳性率(产量未提高的菌株比例)为46.7%,显著低于采用壮观霉素或红霉素单一抗生素进化获得的菌株中假阳性率(73.3%和66.7%)。通过适应性进化与发酵验证得到1株NeuAc产量为(3.16±0.19)g/L的菌株,产量比出发菌株提高了31.7%。为进一步解决发酵过程中重组B.subtilis质粒丢失的问题,通过将必需基因folB(编码二氢喋呤醛缩酶,dihydroneopterin aldolase)插入携带NeuAc合成途径关键酶编码基因重组质粒并且敲除基因组中的folB基因,质粒的丢失率由34.1%下降至11.8%。该研究提升了重组B.subtilis合成NeuAc的产量和稳定性,为重组B.subtilis发酵法生产NeuAc奠定了基础。     

18S rDNA介导的桔青霉核酸酶P1表达载体的构建及表达分析

本研究采用黑曲霉Bdel4菌株为宿主菌,敲除gla A,aam A,An05g02100和An12g06930四个主要的胞外分泌蛋白,为核酸酶P1的表达和分泌提供通路。通过PCR扩增得到黑曲霉Bdel4的r DNA序列,构建了以r DNA序列为整合位点的重组质粒p Rp T-nuc P1-18S和p Rp T-2A-nuc P1-18S,将构建的重组质粒p Rp T-nuc P1-18S和p Rp T-2A-nuc P1-18S转入黑曲霉Bdel4。通过半荧光定量PCR进行转化子初筛,之后测定核酸酶P1的酶活复筛,选出一株高活性菌株用于工业生产。采用SYBR Green实时荧光定量PCR法对含外源目的基因nucP1的总基因组样本重复检测,取平均值作为目的基因拷贝数,探究其与酶活表达水平之间的联系。结果显示含9个nuc P1基因拷贝数的菌株的酶活水平达到88.5 U/mL,较核酸酶P1单拷贝菌株增加了3.86倍,较之前研究中异源表达核酸酶产量提高1.20倍,再增加nuc P1的拷贝数时,酶活水平随着拷贝数的增加而降低。     

高活性谷氨酰胺酶基因glsA_2在枯草芽孢杆菌BJ3-2染色体上的定点整合

以枯草芽孢杆菌BJ3-2的glsA1基因为同源序列,通过构建单交换整合载体,将高活性谷氨酰胺酶基因glsA2定点整合入BJ3-2菌株染色体中,获得能够稳定遗传的重组菌株BJ3-2A2。经检测重组菌株谷氨酰胺酶活力为BJ3-2菌株的3.36倍。利用重组菌株BJ3-2A2发酵豆豉,全氨基酸检测显示,重组菌株发酵的豆豉谷氨酸含量比出发菌株高12.8%。说明枯草芽孢杆菌BJ3-2可以转化且为RecE+菌株,glsA2基因在BJ3-2菌株染色体上可实现较高活性表达,并提高发酵豆豉的鲜味。     

高活性谷氨酰胺酶基因glsA2 在枯草芽孢杆菌BJ3-2染色体上的定点整合

以枯草芽孢杆菌BJ3-2 的glsA1 基因为同源序列,通过构建单交换整合载体,将高活性谷氨酰胺酶基因glsA2 定点整合入BJ3-2 菌株染色体中,获得能够稳定遗传的重组菌株BJ3-2A2。经检测重组菌株谷氨酰胺酶活力为BJ3-2 菌株的3.36 倍。利用重组菌株BJ3-2A2 发酵豆豉,全氨基酸检测显示,重组菌株发酵的豆豉谷氨酸含量比出发菌株高12.8%。说明枯草芽孢杆菌BJ3-2 可以转化且为RecE+ 菌株,glsA2 基因在BJ3-2 菌株染色体上可实现较高活性表达,并提高发酵豆豉的鲜味。     

食品级高产亮氨酸氨肽酶重组Bacillus subtilis的构建和发酵优化

为解决枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在发酵产亮氨酸氨肽酶(leucine aminopeptidase,LAP)需额外添加抗生素的问题,该研究构建了1株食品级产LAP重组B. subtilis。首先通过Cre/lox系统敲除B. subtilis 168基因组中D-丙氨酸消旋酶基因(dal)得到缺陷型菌株BS168 (dal)^-。其次使用高斯组装的方法构建以dal作为标记基因的质粒pMA5-lap-dal (Amp^R,Ori)-并转化至BS168 (dal)^-中得到食品级重组菌BS168 (dal)-/p MA5-lap-dal (Amp^R,Ori)^-。该工程菌发酵产LAP无需添加抗生素且不含抗性基因。对该菌株进行5 L发酵罐条件优化,在转速300 r/min、温度33℃、p H 7. 0、分阶段补料的条件下,酶活最高达到302 U/m L。结果表明,构建的食品级重组B. subtilis产LAP具有潜在的工业应用前景。     

内切葡聚糖酶基因cel7b 在里氏木霉中的同源表达

用里氏木霉（Trichoderma reesei ）作为宿主同源表达内切葡聚糖酶基因。运用聚合酶链反应（PCR）技术从里氏木霉cDNA中扩增得到内切葡聚糖酶基因cel7b序列,并将其连接到载体p18-m2上构建重组质粒,将重组质粒转化到里氏木霉菌株中,通过筛选获得表达内切葡聚糖酶的重组里氏木霉工程菌。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测显示,发酵液中重组内切葡聚糖酶的分子质量约48 ku。摇瓶发酵结果显示,内切葡聚糖酶在重组里氏木霉中得到分泌表达,发酵液中的内切葡聚糖酶和滤纸酶活分别达到了726 U/mL和28.7 U/mL,分别为出发菌株酶活的2.9倍和1.1倍。玉米芯进行糖化试验结果显示,重组里氏木霉所产酶液糖化玉米芯的酶解得率为81.4%,比出发菌株提高了6.3%。     

高效表达木糖醇脱氢酶基因酿酒酵母的构建及木酮糖发酵的初步研究

通过RT-PCR方法克隆得到Candida tropicalis木糖醇脱氢酶基因xyl2,将该基因连入酵母表达载体pYES2的诱导型启动子GAL1下,构建表达质粒pYES2-xyl2;同时用从Pichia pastoris中克隆获取的甘油醛磷酸脱氢酶基因GAP换下GAL1基因,构建含组成型启动子GAP基因的表达质粒pYES2-GAP-xyl2;通过电转化法将其依次转入酿酒酵母S.cerevisiae INVSc1,山梨醇培养基上筛选的转化子经木糖醇梯度驯化培养,筛选出1株耐木糖醇浓度为20%的酿酒酵母重组菌株ZCX4和1株在半乳糖诱导下耐木糖醇浓度为15%的重组菌株YDX2。酶活测定表明,重组菌株ZCX4比酶活0.621 U/mg(蛋白),是YDX2比酶活的2.29倍。摇瓶发酵结果显示,重组菌株ZCX4木糖醇消耗76.46 g/L,木糖醇消耗率为76.46%,是重组菌株YDX2木糖醇消耗率的1.63倍,说明木糖醇脱氢酶实现了高效表达。     

rDNA介导的乳酸克鲁维酵母整合型表达载体的构建及初步验证

构建一个适用于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)稳定的整合型表达载体,并通过鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)来源的腺苷酸脱氨酶基因(AMPD)的表达对该载体进行初步验证。以质粒pMD 19T-simple为空骨架,K. lactis GG799来源的18S rDNA序列为同源重组位点,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的半乳糖苷酶启动子(pScGAL7)为外源基因调控元件,乙酰胺酶基因(amdS)为筛选标记,AMPD为报告基因,构建重组表达载体pTRGA-amdS。载体经Sac Ⅱ线性化后,去除了大肠杆菌(Escherichia coli)来源的ori和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),将同源重组片段电转化K. lactis GG799得到重组菌,利用实时荧光定量PCR (RTQPCR)测定重组菌AMPD基因整合拷贝数为1～3,AMP脱氨酶酶活测定结果表明:酶活与拷贝数呈正相关,含3个整合拷贝的重组菌在半乳糖诱导下酶活提高了32.6%,达到(590±13.33) U/mL。在无选择压力下重组菌连续生长58世代稳定性为98.59%。通过载体pTRGA-amdS的构建与应用实现了外源基因在K. lactis中的稳定表达,初步探究了18S rDNA在同源重组中的作用,为K. lactis的进一步分子改造提供参考。     

灵杆菌胞外核酸酶在短短芽孢杆菌中的高效表达

利用短短芽孢杆菌（Brevibacillus choshinensis）原核表达系统对灵杆菌胞外核酸酶（Serratia marcescens non-specific nuclease,SMNE）进行重组表达,以期获得高产量重组SMNE。利用大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体构建SMNE重组质粒,实现其在B. choshinensis HD31-SP3菌株中的表达。通过粗酶活检测验证其活性后,首先对温度、甘油和发酵时长等发酵条件进行优化,随后将获得的重组SMNE经亲和层析、凝胶阻滞层析分离纯化后进行酶活性质表征检测。经B. choshinensis HD31-SP3菌株重组表达的SMNE,初测胞外酶活为4.07×10⁶ U/L。经发酵条件的优化测试,最终在培养基中加入终体积分数5%甘油,于30 ℃下摇瓶培养56 h,获得的发酵上清胞外酶活可达2.6×10⁷ U/L,是未优化条件的6倍;经蛋白质纯化条件筛选,最终经一步亲和纯化后SMNE回收产量即达30~40 mg/dL,比活力为1.3×107 U/mg,为商业化对照的2~3倍。通过对该酶的酶学性质鉴定后发现：该酶最适反应条件为37~45 ℃,pH 8~9;在不存在Mg²⁺/Mn²⁺的情况下仍保持47%的活性,且在300 mmol/L Na+/K+条件下可保持35%~45%的活性。     

布氏乳杆菌细菌素BSX01对金黄色葡萄球菌及其生物被膜形成的影响

为评估布氏乳杆菌所产细菌素在食品工业中的应用潜力，通过培养布氏乳杆菌获得具有抑制金黄色葡萄球菌的抑菌活性物质，经纯化后鉴定其相对分子质量大小与抑菌特性，并对抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成进行探讨。结果发现，布氏乳杆菌在37 ℃ MRS培养基中培养至20 h后进入稳定期，在26 h时对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达峰值，为（26.36±0.86） mm。 通过АKTA pure系统串联Superdex 30 Increase纯化后，鉴定得到抑菌活性物质（BSX01）的相对分子质量为773.56，对多种蛋白酶敏感，推测为Ⅰ类细菌素。在pH 10(2 h)和121 ℃(30 min)处理后，BSX01仍具有较好的抑菌活性，最小抑菌质量浓度（MIC）仅为12.50 μg/mL。此外，BSX01在1/2 MIC时可有效降低金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，在2 MIC时能够完全抑制生物被膜的形成。基于上述结果，布氏乳杆菌产生的细菌素BSX01是食品工业中的潜在生物防腐剂和抑制食源性致病菌生物被膜形成的有效候选品。     

枸杞酸奶体外抗氧化活性和保肝功能研究

采用枸杞原浆作为添加到酸奶中的功能成分,探索枸杞酸奶的抗氧化活性和保肝功能.在体外抗氧化活性实验中,采用了铁氰化钾法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)法和水杨酸法.结果表明在枸杞原浆添加一定体积分数范围内,枸杞酸奶总抗氧化还原能力、DPPH自由基清除...     

玛咖复合黄精和桔梗调节糖脂代谢作用的研究

旨在探讨玛咖、黄精和桔梗3种原料的水提物复方,在细胞水平对调节糖脂代谢的作用。用超声波辅助法分别提取玛咖、黄精和桔梗的水溶性成分,得到玛咖（maca）水提物,将黄精（HJ）水提物和桔梗（JG）水提物按质量比为1∶1的比例混合得到黄精-桔梗（HJJG）水提物。采用游离脂肪酸、果糖和葡萄糖诱导人肝癌细胞株（HepG2）细胞,建立糖脂代谢紊乱模型。以二甲双胍作为阳性对照组,分别评价质量浓度为0.25、0.5、1 mg/mL的maca水提物、HJJG水提物以及两者复配物对模型细胞的影响。测定的指标包括模型细胞的葡萄糖吸收量、细胞内糖原、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）的含量以及细胞内活性氧自由基（ROS）的水平。结果表明,玛咖和黄精-桔梗复配后能够通过促进糖吸收和细胞内糖原合成,以及降低细胞内TC含量和ROS水平P＜0.05）,调节模型组HepG2细胞糖脂代谢,其中质量浓度为1 mg/mL的玛咖和1 mg/mL HJJG（1∶1,体积比）复配后改善效果较优。     

云南不同品种大叶种茶树生化成分季节变化特征分析

探讨品种及季节对云南大叶种茶树生化成分的影响,为茶树种植品种及茶叶加工采摘季节的选择提供一定理论依据.采用云南大叶种云抗10号、云抗14号、雪芽100号、佛香2号和紫娟共5个品种为供试材料,在春、夏和秋三季,分别取其新梢的一芽二叶进行蒸青固样,分析不同季节5个茶树品种主要生化成分(水分、水浸出物、茶多酚、儿茶素组分、氨...     

链霉菌SG17代谢产物对玉米黄曲霉的抑制作用及其稳定性分析

黄曲霉是玉米贮存过程中主要的污染之一,直接影响食品以及饲料的品质和安全.利用微生物及其代谢产物进行生物防治具有广泛的应用价值.作者以前期筛选获得的SG17菌株为材料,通过形态学观察、生理生化检测及16S rRNA序列分析,初步确定为链霉菌;平板对峙实验显示该菌株能够显著抑制黄曲霉等多种病原真菌的生长,具有一定的广谱性;...     

枸杞多糖体外调节人体肠道菌群的功能研究

为研究枸杞多糖(LBP)对人体肠道菌群结构和代谢产物的影响,对6名健康人的粪便提取物进行单独样本与混合样本的体外模拟厌氧发酵,利用16S rRNA基因高通量测序技术对发酵后肠道菌群进行结构和功能分析,并利用超高效液相色谱(UPLC)检测发酵液中的短链脂肪酸(SCFAs)浓度。结果表明,LBP能够明显改变人体肠道菌群结构与功能,提高肠道菌群中益生菌乳酸杆菌属与双歧杆菌属的丰度,并促进了SCFAs的产生。因此,LBP能够显著影响人体肠道菌群结构与功能。     

EMA结合实时荧光PCR方法检测单核细胞增生李斯特氏菌

建立叠氮溴化乙锭（EMA）结合实时荧光PCR（qPCR）方法检测单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）活菌。以李斯特溶血素O（LLO）基因hly设计引物、TaqMan探针,用李斯特属典型菌、沙门氏菌等56株致病菌株验证特异性,不同质量浓度EMA处理进行qPCR检测。尝试脱氧胆酸钠溶液（SD）强化抑制效果,73份不同的人工污染食品、环境样本（卤鸡肉、牛奶、肉馅、垃圾渗滤液）测试实用性。结果表明,引物探针准确检测L. monocytogenes,对其他菌株无特异性扩增。EMA最适质量浓度2.5 μg/mL,经过15 min光激活与死菌DNA共价结合明显抑制了扩增,方法检出限为150 CFU/mL。SD处理L. monocytogenes活菌Ct值增加。与传统培养法比较,EMA-qPCR方法检测100 %准确,操作简单、省时高效,在食品、环境方面应用前景广阔。     

农杆菌介导转化黑曲霉条件优化及脂肪酶表达

优化了农杆菌介导转化黑曲霉的方法,优化条件包括共培养材料、农杆菌种类、诱导剂浓度、共培养时间、共培养温度以及共培养时农杆菌的菌体浓度。结果表明,农杆菌介导转化黑曲霉的最适条件为107个/mL不萌发的新鲜孢子与OD_(600)培养至0.9～1.0的农杆菌以1∶1的比例混合后,在乙酰丁香酮浓度为200μmol/L的IM平板上,23℃避光培养48 h后进行转膜,转化子个数可达到(60±5)个转化子/10~6个孢子,且阳性率达到90%以上。并且构建了同源黑曲霉脂肪酶的组成型和诱导型启动子表达载体,通过优化后的农杆菌介导转化方法转化至黑曲霉中,利用罗丹明橄榄油平板对产酶转化子进行筛选鉴定,并获得了阳性克隆。     

鼠李糖乳杆菌利用不同益生元的增殖及耐受性研究

作者旨在通过对比鼠李糖乳杆菌（Lactiplantibacillus rhamnosus）与不同益生元组合后,在生长情况、pH和胆盐耐受性及乳酸产量方面的变化筛选出鼠李糖乳杆菌与益生元的最佳组合。结果表明,鼠李糖乳杆菌GG（L. rhamnosus GG, LGG）、鼠李糖乳杆菌HN001在以低聚半乳糖为唯一碳源生长时,最大生物量分别为1.253、1.552,最大比生长速率分别为0.316、0.290 h^-1,乳酸产量分别为3.654、10.914 g/L,与其他益生元组合相比,表现出显著优势。为验证这两种组合在不同胁迫条件下的生长情况,进一步测定了其在不同pH和胆盐质量浓度下的耐受性。这两种组合在1 g/L胆盐条件下的最大生物量分别为0.712和0.694,在pH 4.0条件下的最大生物量分别为0.639和0.728,与其他组合相比存在极显著差异。该研究结果有助于推动鼠李糖乳杆菌与低聚半乳糖组合在食品、医疗等领域的广泛应用,为后续益生菌-益生元组合产品的开发提供了理论依据。