第6代百日咳疫苗效力国家标准品的建立

目的建立第6代百日咳疫苗效力国家标准品。方法选用百日咳菌株(沪64-21),发酵罐培养,收获的百日咳菌液经脱毒灭活后,分装冻干,作为备选品,按《中国药典》三部(2010版)进行无菌试验、血清学试验、水分含量及百日咳特异性毒性检测。以WHO标准品PWIS和中国百日咳疫苗效力国家标准品3号、5号为标准,经5个实验室进行协作标定,并考察其效力稳定性。结果该备选标准品的各项检测指标均符合国家标准品的规定;经协作标定45次,分别以国家标准品3号、5号和WHO标准品为标准进行量值溯源,标定结果差异无统计学意义(P>0.05);最终合并效价为13 IU/ml(95%CI=12.23～13.26 IU/ml);保存期内标准品的效力稳定。结论该备选标准品各项指标均符合要求,可作为新的第6代百日咳疫苗效力国家标准品使用。     

我国无细胞百白破联合疫苗中百日咳疫苗的批签发及效力试验的回顾性分析

<正>现在几乎全世界都在实施百日咳疫苗的免疫接种,但百日咳仍然是威胁人类健康的重要传染病之一,也是导致婴幼儿死亡的主要原因之一[1]。目前,百白破联合疫苗包括全细胞百白破联合疫苗(DTwP)和无细胞百白破联合疫苗(DTaP),前者于     

第5批百日咳疫苗效力国家标准品的建立

目的　建立第 5批百日咳疫苗效力国家标准品。方法　选用百日咳菌株 (编号 5 80 0 4 ) ,采用B G培养基固体培养 ,将培养的百日咳菌液经脱毒灭活后分装冻干。以WHO的效力标准品 # 3和中国效力标准品 # 4为标准进行协作标定。结果　该标准品经 7个实验室协作标定 6 3次 ,最终合并效价为 14IU ml(95 %CI=13 10 9～15 32 0 )。结论　第 5批百日咳疫苗效力标准品各项指标均符合要求 ,可以作为新的国家百日咳效力标准品使用 ,效价拟定为 14IU ml。     

无细胞百日咳疫苗纯化新工艺的建立

目的建立适合大规模生产的无细胞百日咳疫苗(Acellular pertussis vaccine,APV)纯化新工艺,使疫苗主要成分的比例稳定可控。方法复苏百日咳菌种并传代培养,在大罐发酵培养收获前,调整菌液的pH值至弱酸性,再通过离心获得上清液,经超滤浓缩和脱盐处理,使用阳离子交换层析进行目的组分的分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE分离并经Western blot鉴定,确定最佳纯化条件。用建立的层析纯化新工艺连续纯化3批APV,检测各项指标,验证该工艺的重复性。结果收获前菌液pH值调至5.8～6.0,可使疫苗主要保护抗原在上清液中的含量明显提高;采用强阳离子交换层析的方法,从目的蛋白的捕获到多组分的分离提纯可一步完成,各目的蛋白组分的纯度均可达85%以上,回收率可达90%以上;建立的纯化新工艺具有良好的重复性。结论初步建立了可线性放大、适合APV大规模生产的层析纯化新工艺,为疫苗质量标准的提高奠定了基础。     

无细胞百日咳疫苗血清学效价检测方法的建立及适用性的初步验证

目的建立无细胞百日咳疫苗血清学效价检测方法(PSPT),并对其适用性进行初步验证。方法采用纯化的百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)包被酶标板,以羊抗鼠IgG酶标抗体为指示抗体,建立检测小鼠抗PT抗体和抗FHA抗体的间接ELISA法,并对该方法进行初步验证。在此基础上建立PSPT法,并与MICA法进行相关性分析。结果建立了小鼠抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA,标准曲线线性范围内R≥0.99;经验证,两系统与无关抗体之间均无交叉反应;检测限度分别为93.7500和59.0625mEU/ml,检测限量分别为100和70mEU/ml。将10批无细胞百日咳原液分别以PSPT法和MICA法进行效价测定,两者呈正相关,两种方法检测结果差异无统计学意义,且PSPT法比MICA法重复性更好。结论抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA灵敏度高,准确性及精密性均较好,在此基础上建立起来的PSPT法有望替代MICA法,用于检测无细胞百日咳疫苗的效价。     

无细胞百日咳疫苗中百日咳毒素活性检测方法的建立

目的建立检测无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine,APV)中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)活性的胎球蛋白结合试验ELISA方法。方法优化APV中PT残余含量的胎球蛋白结合试验ELISA检测方法,分析不同抗原稀释液对该方法的影响,并对该方法进行线性、精密度、灵敏度、特异性验证。分析丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)、百日咳黏着素(pertactin,Prn)、白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)、破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)在成品疫苗剂量时(即50μg/ml、16μg/ml、25 Lf/ml、7 Lf/ml)对PT与胎球蛋白结合的影响,确定疫苗解吸附条件,并对不同厂家的8批吸附无细胞百白破联合疫苗进行解析附后,检测PT含量,计算CV。结果在胎球蛋白包被浓度为5μg/ml时,使用p H 8.5含1%胎牛血清白蛋白(BSA)Tris缓冲液对样品进行稀释后,直接用酶标抗PT抗体进行检测,建立的胎球蛋白结合试验ELISA检测方法的剂量反应曲线线性良好(r均0.99);试验内CV为13.74%~5.85%,试验间CV为2.75%~10.39%,灵敏度可达4 ng/ml,精密度好,灵敏度高;降低了PTd的干扰作用,特异性较好。FHA、Prn、DT、TT在成品疫苗剂量时对PT与胎球蛋白的结合无影响;确定疫苗解吸附条件为Tris-柠檬酸钠溶液(4%,w/v)(p H 8.5);各批疫苗3次检测结果的CV值均符合要求,重复性较好。结论优化后的胎球蛋白结合试验ELISA检测方法可用于APV中残余PT含量的检测。     

无细胞百日咳疫苗毒性体外检测方法的建立

目的建立无细胞百日咳疫苗毒性体外检测方法。方法依据活性PT的ADP核糖基化酶活性,设计并合成一段荧光标记的合成肽Gαi3C20,以其为底物,采用柱前衍生-HPLC法检测无细胞百日咳疫苗的毒性,并对建立的方法进行验证。结果该方法的最低检测限为1 ng;最低定量检测限为8 ng,线性范围为8⁴00 ng/ml,区间内线性系数为0.999;用建立的方法对同一份样品平行测定10次,变异系数小于10%;该方法的回收率为94.9%;联合疫苗中的其他主要成分,如丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)、黏附素(pertactin,PRN)、白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)、破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)对检测结果无明显干扰。结论建立了无细胞百日咳疫苗毒性体外检测方法,该方法有望替代现行的动物检查法,可加强我国百白破联合疫苗的质量控制,提高疫苗的质量。     

无细胞百日咳疫苗质量控制方法的建立

目的建立我国无细胞百日咳疫苗组分含量和纯度的检测方法。方法应用ELISA方法对生产过程中组分含量(PT和FHA)进行分析,SDS-PAGE和PAGE方法对疫苗原液中PT和FHA的纯度进行测定。结果通过对生产过程中组分含量的测定,绘制出组分动态图,可以实时监控生产过程中有效组分的变化。检测疫苗原液中PT和FHA纯度的SDS-PAGE法的分辨率较高,但PAGE法条带少,易于分析。结论所建立的质量控制方法可用于我国无细胞百日咳疫苗的质量控制。     

百日咳毒素参考品的制备及鉴定

目的制备百日咳毒素(pertussis toxin,PT)参考品,并进行鉴定。方法将百日咳杆菌培养上清经珍珠岩和羟基磷灰石两步吸附层析纯化后获得PT,进行SDS-PAGE、ELISA、斑点免疫印迹及血凝效价检测。结果纯化后PT纯度可达99%以上;相同抗原含量的纯化后PT和NIBSC标准品与PT单克隆抗体均为阳性反应,与FHA单克隆抗体均为阴性反应;纯化后PT和NIBSC标准品均可与PT单克隆抗体产生明显的反应斑点,与FHA单克隆抗体无反应斑点,Sigma公司PT参考品与PT单克隆抗体有明显反应斑点,与FHA单克隆抗体有微弱反应斑点;纯化后PT和Sigma公司PT参考品的血凝效价分别为1∶32和1∶64。结论成功制备了较高纯度的PT,有望作为参考品用于PT抗原含量检测、抗PT血清抗体滴度检测及抗原纯度检测。     

无细胞百日咳疫苗研发与接种现状及前景

百日咳是传染性极强的呼吸系统疾病,主要影响婴幼儿。接种疫苗是预防百日咳感染的有效措施。无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccines,aPVs)因副作用更小,在许多国家已取代全细胞百日咳疫苗(whole-cell pertussis vaccines,wPVs)。尽管疫苗接种覆盖率较高,但aPVs的免疫力维持时间较短,被认为是百日咳重现的重要原因。针对百日咳疫苗的改进,基因脱毒疫苗及减毒活疫苗已取得了明显的临床效果,其他改进策略包括在现有aPVs中使用新型佐剂、增加抗原,或采用纳米颗粒包装等也具有良好的发展前景。本文就目前aPVs的抗原组分和保护效果,不同国家的接种程序,及潜在的百日咳疫苗候选组分和预防百日咳的新策略作一综述。     

无细胞百日咳疫苗中活性PT的保护作用

目的 比较经基因工程方法脱毒的无细胞百日咳疫苗(APV)中不同含量活性PT的保护作用。方法 用小鼠保护性试验(AMPT)评价不同含量活性PT疫苗样品的百日咳效力,组织胺致敏试验(HST)检测不同含量PT样品中PT活性。结果 含5ng活性PT的疫苗与不含PT的疫苗效力差异无显著意义;含50ng活性PT疫苗与不含和含5ng活性PT的疫苗效力差异有显著意义。用HST肛温测定法可以检测到含50ng活性PT的样品中PT活性。结论 AMPT适用于高度脱毒或基因工程脱毒的APV的效力检定,HST肛温测定法可以证实APV中PT的活性。     

无细胞百日咳疫苗生产用菌株CS的5种保护性抗原基因序列分析

目的对我国无细胞百日咳疫苗生产用菌株CS的5种保护性抗原的基因序列进行分析。方法分别用PCR扩增CS菌株的PT、FHA、PRN、FIM2和FIM3基因,克隆至pGEM-TEasy vector中,进行序列测定及分析,并确定其基因型。结果获得了CS菌株PT、FHA、PRN、FIM2和FIM35段基因克隆,其核苷酸和氨基酸序列与GenBank中收录的相应百日咳杆菌的同源性均在90%以上,种系进化树分析结果与鲍特菌属进化结果一致。CS的基因型为:PTS1属于ptxS1B型,PTS3属于ptxS3A型,FHA属于FHA1型,PRN属于PRN1型,FIM2属于FIM2-1型,FIM3属于FIM3A型。结论本研究为更好地对我国无细胞百日咳疫苗进行质量控制和百日咳杆菌的基因漂移研究奠定了基础。     

百日咳疫苗血清学效力试验与小鼠保护力试验结果的相关性

目的 了解百日咳疫苗血清学效力试验（ＰＳＰＴ）与小鼠保护力试验（ＭＰＴ）结果的相关性,为该法替代ＭＰＴ积累资料。方法 用不同剂量的ＤＴＰ疫苗免疫小鼠,４ｗ后采血,用ＥＬＩＳＡ测定小鼠血清中抗百日咳菌表面 抗原的总抗体滴度。用平行线法计算疫苗的效力,与ＭＰＴ测定结果进行相关性分析。结果１５批疫苗分别用 ＰＳＰＴ和ＭＰＴ法测定的效力单位相关性显著（ｒ＝ ０．９３５８,ｐ＜０．００１）,二者差异无显著意义（Ｐ＞０．０５）。与 ＭＰＴ法相 比,ＰＳＦＦ法有更高的重复性,而且９５％可信限较小。结论ＰＳＰＴ法有望取代ＭＰＴ。     

无毒性逆转的无细胞百日咳菌苗制备

将百日咳菌培养物上清液,经一段硫酸铵盐析提取百日咳主要保护性抗原 FHA 和 PT,用蔗糖密度梯度离心去除内毒素,以戊二醛解毒制成无细胞百日咳菌苗。该菌苗对家兔不产生热原反应,对小鼠毒性低,不引起明显的白细胞增多及组胺致敏活性,小鼠免疫后对百日咳毒菌脑腔攻击具有很好的保护作用,并可产生较高的抗体应答。菌苗经37℃保存3个月未出现毒性逆转现象,质量稳定,为大批量制造质量均一的无细胞百日咳菌苗提供了可能性。     

无细胞百白破b型流感嗜血杆菌联合疫苗的研制

目的研制无细胞百白破b型流感嗜血杆菌联合疫苗(DTaP/Hib)。方法按不同抗原配比配制3组联合疫苗,分别检测疫苗的效价及安全性,从中选择最佳配比配制3批联合疫苗,并用相应批原液,按相同配比配制3批DTaP和3批Hib疫苗作为对照,检测联合疫苗中抗原的相容性。结果3组配比的联合疫苗效价及安全性均达到《中国药典》三部(2005版)要求,联合疫苗中以每毫升含AcP18μgPN、D25Lf、T7Lf和Hib多糖抗原20μg为最佳配比。动物实验证明联合疫苗各抗原间不存在免疫干扰。结论已成功研制4种抗原配比合理的DTaP/Hib联合疫苗。     

口服脊髓灰质炎疫苗效力标准品国际协作研究

目的评价第2代脊髓灰质炎疫苗效力国际标准品的适用性,并确定其标示滴度。方法由WHO参考实验室英国国家检定所(NIBSC)组织协作研究,并提供测定样本及单克隆抗体,共有13个实验室参加,各实验室分别采用单抗及内部参考品进行测定,结果递交NIBSC进行总结。结果本实验室对各样本测定的结果与各实验室测定结果均值总体上是一致的,变异系数基本在5%以下。结论本实验室目前采用的病毒滴度测定方法及试剂的敏感性、标准化程度均与国际一致。     

卵清蛋白国家定量参考品的建立

目的建立卵清蛋白国家定量参考品。方法用德国试剂盒测定不同厂家、不同级别卵清蛋白的含量,筛选与试剂盒标准卵清蛋白含量符合率最高的样品作为参考品原料,并对参考品保护剂进行验证。将参考品贮存母液系列稀释后,经3个实验室协作标定,确定其标示量。结果选取SigmaGⅡ作为参考品原料;参考品保护剂对卵清蛋白测定结果无影响,并可显著提高参考品的稳定性;经协作标定,确定浓度为15、10、5和2.5ng/ml系列参考品的标示量分别为(17.96±1.00)、(12.25±1.51)、(6.79±1.14)和(3.11±0.31)ng/ml。结论已建立了含量准确,重复性和线性较好的卵清蛋白国家定量参考品。     

用无细胞百日咳抗原配制的吸附精制百白破制剂的特性和人群反应及血清学效果

用50L发酵罐培养百日咳菌,经硫酸铵盐析法提取保护性抗原,戊二醛解毒后,与白喉、破伤风类毒素及Al(OH)_3配合制成的吸附精制百白破制剂(APDT),质量符合规程要求。给3～5月龄婴幼儿接种后全身和局部副反应很低,与现行吸附百白破制剂(WPDT)有非常显著性差异。免后血清中抗-PT和抗-FHA抗体均有显著增长,与WPDT制剂组相比,APDT的抗-PT和抗-FHA抗体增长更为显著。APDT免后抗白喉、抗破伤风抗体滴度均超过保护水平。本制剂的质量及免疫效果均达到了国外同类产品水平。