治疗性肝癌单克隆抗体HAb18生产用种子细胞的质量控制

目的进行治疗性肝癌单克隆抗体HAb18生产用种子细胞的质量控制研究。方法用细胞计数、ELISA和FCM分别检测细胞生长、抗体生成速度和抗原结合活性;冻存细胞复苏后及体外传代3个月,检测抗体分泌稳定性和克隆阳性率;进行无菌检查、细胞核型和同工酶谱分析,了解细胞遗传稳定性、外源因子污染和细胞间交叉污染情况。结果肝癌单克隆抗体HAb18生产用种子细胞的细胞生长和抗体生成速度分别为0.047~0.052/h和1.1~1.4 pg/cell.h,与靶细胞FHCC98结合的阳性率达99%,平均荧光强度在200以上。冻存细胞复苏后及体外连续传代3个月后,其特异性抗体生成速度维持在1.0 pg/cell.h以上,培养上清抗体效价仍为1∶1 000。不同批次的生成细胞核型均符合杂交瘤细胞特征,外源因子检查阴性,无细胞间交叉污染。结论HAb18生产用种子细胞的细胞生长和抗体生成速率、抗体稳定性和特异性均符合已建立的规模化放大培养的种子细胞质控标准。     

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段单克隆抗体的制备

目的制备抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段(sTRAIL)的单克隆抗体。方法用重组sTRAIL免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,捕获ELISA筛选阳性克隆,制备腹水抗体。间接ELISA测定单抗效价,并进行单抗亚类、特异性鉴定及杂交瘤细胞染色体和单抗识别位点分析。将杂交瘤细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后,检测细胞培养上清的效价。结果3株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgG1型,腹水单抗效价均高于10-6,杂交瘤细胞染色体数介于94～98条之间,均识别sTRAIL分子上线性表位。细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后的上清效价保持稳定。结论已成功制备了3株可稳定分泌抗sTRAIL单克隆抗体的杂交瘤细胞,为TRAIL的定性定量检测及组织表达分析奠定了基础。     

抗霍乱弧菌O1群单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗霍乱弧菌O1群特异性单克隆抗体(McAb),并进行鉴定。方法以福尔马林灭活的O1群霍乱弧菌免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术建立分泌抗O1群霍乱弧菌McAb的杂交瘤细胞株。对配对较好的6个细胞株分泌的McAb进行腹水效价、免疫球蛋白类及亚类、抗体亲和常数测定及凝集试验和稳定性试验。与细菌培养法对比检测208份临床标本。结果6个细胞株分泌的McAb腹水效价均为105,均为IgM;抗体亲和常数为1.84×105～5.38×107;且均与O1群霍乱弧菌菌株发生凝集反应,与霍乱弧菌O139群、大肠杆菌、出血性大肠杆菌O157∶H7、副溶血弧菌、麦弧菌、河弧菌、结肠炎耶尔森菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及各型副伤寒杆菌均不发生凝集反应。6个分泌McAb的细胞株连续培养15周,经液氮冻存12个月后复苏,仍能稳定分泌抗体;与细菌培养法对比检测208份临床标本,特异性和灵敏度均达100%。结论制备的McAb具有较高的特异性,有可能用于开发霍乱弧菌O1群的检测试剂。     

抗人CD25人鼠嵌合抗体在CHO细胞中的稳定表达及初步鉴定

目的在CHO细胞中稳定表达抗人CD25人鼠嵌合抗体,并对抗体活性进行初步鉴定。方法采用脂质体法将嵌合抗体真核表达质粒pOptiVEC-H和pcDNA3.3-L共转染CHO-DHFR-细胞,通过去除HT和在培养基中加入500μg/ml的Geneticine进行阳性克隆的筛选,有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆,通过在培养基中加入浓度逐步增加的MTX提高克隆的抗体表达量。采用流式细胞术(FCM)检测嵌合抗体的抗原结合活性及人抗体重链Fc段、轻链κ链;提取细胞基因组进行PCR鉴定;抗体经超滤浓缩后,采用蛋白G亲和纯化法进行纯化,并进行Westernblot分析;体外连续培养细胞株2个月及冻存、复苏后,采用ELISA法检测抗体分泌的稳定性。结果获得稳定分泌嵌合抗体的细胞株1C1,ELISA检测抗体表达量为103ng/ml;PCR结果表明,表达的质粒已整合入细胞基因组中;FCM及Westernblot结果显示,嵌合抗体含有人抗体重链Fc段及轻链κ链,且保留了鼠抗体V区的抗原结合特异性;经蛋白G亲和纯化后,获得抗体220μg,纯度>97%;体外连续培养细胞株2个月及冻存、复苏后,抗体分泌保持稳定。结论获得了稳定表达人CD25人鼠嵌合抗体的CHO细胞株,其具有鼠源抗体的抗原结合特异性及人抗体的恒定区。     

重组戊型肝炎疫苗菌种库的建立及其稳定性

目的建立重组戊型肝炎疫苗工程菌三级种子库,并分析其稳定性。方法将工程菌株HEV179/BL21(DE3)复苏活化,经全面检测合格后冻干保存即为原始种子库;原始种子库传代扩增,经全面检定合格后,冻干保存即为主种子库;主种子库经传代扩增和全面检定合格后,甘油冻存即为工作种子库。对三级种子库进行全面检定,并对工程菌进行冻干及甘油冻存稳定性、甘油冻存时间稳定性及质粒稳定性检测。结果建立的三级种子库经全面检定合格;菌种冻干稳定性、甘油冻存稳定性、甘油冻存时间稳定性及质粒稳定性指标均合格,菌种生长特性、遗传和表达稳定性均未发生变化。结论成功建立了HEV179/BL21(DE3)工程菌三级种子库,菌种稳定性良好,适用于重组戊型肝炎疫苗的工业化生产。     

分泌抗HBsAg-抗HRP双特异单克隆抗体杂交-杂交瘤的建株

用分泌抗-HBs Ag单克隆抗体的杂交瘤细胞的8-氮杂鸟嘌呤(8-AG)耐受株作为亲本细胞,与辣根过氧化物酶(HRP)免疫的BALB/c小鼠脾细胞进行第2次融合,从382个克隆上清中筛选出一株分泌抗-HBs Ag-抗-HRP双特异抗体的阳性孔。经多次克隆纯化建立3株杂交-杂交瘤,命名为Bs33、Bs38和Bs39,其抗体均属Ig G_1型。细胞染色体平均为113条。细胞反复冻存、复苏、传代仍稳定分泌双特异抗体。     

戊型肝炎病毒重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒的制备

目的制备戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒。方法以4型HEV ORF2重组蛋白P179免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法进行克隆化培养,制备腹水,并对杂交瘤细胞进行染色体计数,鉴定单抗亚类及特异性、并检测稳定性;经SDS-PAGE分析抗体纯度,以兔抗179抗原多抗作为包被抗体,HRP标记P179单抗作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法,制备试剂盒,并进行最佳线性范围测定、准确性、精密性和稳定性验证。结果获得4株能稳定分泌抗P179抗原单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3A10、3F8、4E9和5G6,腹水抗体效价分别为1∶10-7、1∶10-6、1∶10-6和1∶10-7,染色体数分别为96、98、101和99条;亚类分别为IgG2a、IgG2a、IgG1和IgG2b;4株单抗连续传代3个月,液氮冻存1年抗体效价未发生变化;制备的试剂盒有良好的线性(R2>0.950 0)、准确性、精密性,试验内变异系数为4.17%～6.26%,回收率在87.9%～114.8%之间,试验间变异系数为5.82%～8.01%,回收率在90.8%～108.9%之间;于37℃及4℃放置3 d,仍具有良好的稳定性。结论成功制备了戊型肝炎病毒P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒,可用于戊型肝炎疫苗生产中定量检测疫苗抗原。     

幽门螺杆菌HpaA蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用

目的 制备幽门螺杆菌(H.pylori)HpaA蛋白单克隆抗体,并检测其对H.pylori黏附胃腺癌细胞AGS的抑制作用。方法应用PCR法扩增HpaA基因,构建重组表达质粒pQE30-HpaA,表达并纯化重组HpaA蛋白;以其为抗原免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,采用间接ELISA和Western blot法检测单抗的特异性,间接ELISA检测细胞株培养上清和腹水抗体效价,并对其进行亚型鉴定和杂交瘤细胞株稳定性分析;扫描电镜观察重组HpaA蛋白单抗对H.pylori黏附AGS细胞的抑制作用。结果重组表达质粒pQE30-HpaA经双酶切、PCR及测序证明构建正确;表达的重组HpaA蛋白相对分子质量约为30 000,可溶性蛋白含量约占65%,纯化后纯度达85%以上;经细胞融合及筛选克隆获得了2株能稳定分泌抗HpaA单抗的杂交瘤细胞株,2株单抗与其他肠道细菌均无交叉反应,能与H.pylori全菌体发生特异性反应;乳胶凝集试验证明,该单抗属IgG3、κ型;2株单抗细胞培养液的抗体效价分别为1∶128～1∶256和1∶64～1∶128,腹水抗体效价分别可达1∶6 400～1∶12 800和1∶1 600～1∶3 200;杂交瘤细胞经反复冻存、复苏及多次传代,仍能稳定分泌高效价抗体;单抗可抑制H.pylori对AGS细胞的黏附作用。结论已成功制备了H.pylori HpaA蛋白单克隆抗体,为建立新的H.pylori现症感染诊疗方法奠定了基础。     

抗猪呼吸与生殖综合征病毒Nsp9蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗猪呼吸与生殖综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法用纯化的重组Nsp9蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9蛋白单克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验分析单抗的特异性;使用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒鉴定单抗的亚类;将杂交瘤细胞分别保存1、2、3、4个月后复苏,采用间接ELISA法检测细胞分泌抗体的能力。结果共获得3株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2D6、3C11和4E6,其细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶6 400、1∶3 200和1∶1 600,腹水的ELISA效价分别为1∶640 000、1∶512 000和1∶256 000。3株单抗均可与Nsp9蛋白和PRRSV特异性结合;2D6和3C11株单抗的Ig亚型为IgG1,4E6株单抗为IgM亚类抗体;3株杂交瘤细胞保存4个月均能稳定分泌单抗。结论已制备抗PRRSVNsp9蛋白单克隆抗体,其特异性高,稳定性良好,为建立鉴别自然感染与注射疫苗感染PRRSV的诊断方法提供了材料。     

原核表达质粒(pTrcHis)载体蛋白单克隆抗体的制备及应用

应用两种在pTrcHis上表达的融合蛋白rp15 0C和rp5 2C免疫BALB/c小鼠后 ,获得 2株分泌抗pTrcHis载体蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞 1C4和 3C10。其中 1C4为IgG3 ,腹水ELISA效价为 1∶2× 10 6;3C10为IgM ,腹水ELISA效价为 1∶6 0 0。实验表明 ,1C4分泌的抗体用于pTrcHis表达蛋白的检测具有很好的特异性 ,对工程菌体蛋白无非特异性反应。辣根过氧化物酶HRP标记 1C4后 ,用于组装HCMVIgM检测试剂盒 ,检测HCMVIgM阳性血清 ,得到了满意的结果     

流行性出血热病毒单克隆抗体的研究

应用流行性出血热病毒(EHFV)Z_(10)株制备的疫苗免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与BALB/c小白鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,获得10株能分泌ENFV特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞,其McAbs小鼠腹水荧光抗体滴度达1:2000～1:51200。经免疫印迹试验及ELISA夹心法证明1 0株McAbs为抗EHFV核蛋白(NP)的McAb,均不具有中和抗体活性,有低滴度的血凝抑制活性;经间接免疫荧光试验(IFAT)证明,2株为组特异性的McAb,5株为亚组特异性的McAb,3株为型特异性的McAb。实验用冻存免疫脾细胞进行杂交获得成功,为杂交瘤细胞的研究提供了经验。     

鼠抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高中和活性的鼠抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组TNF-α免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗TNF-α单抗,纯化后,用间接ELISA法和微量细胞病变MTT法检测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸铵洗脱法测定单抗的相对亲和力指数,并进行类及亚类、细胞染色体核型、特异性及稳定性检测。结果筛选出7株分泌抗TNF单克隆抗体的细胞株,其中6株具有较高的中和活性和良好的稳定性,其细胞上清及腹水的中和效价分别为1∶40～1∶160和(1～3)×10-4,7株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,5H10株与其余6株有不同的抗原表位,相对亲和力指数为0.4～1.5mol/L。结论已成功制备具有高中和活性的鼠抗TNF-α单克隆抗体,为抗人TNF-α嵌合抗体的构建奠定了基础。     

重组人γ-型干扰素单克隆抗体的鉴定

5株小鼠杂交瘤细胞ID5、1C10、1C11、3H9和6F8，所分泌抗重组人γ－型干扰素（rIFN－γ）单克隆抗体经双扩散试验证明其中4种为小鼠IgG1型，另一种为IgG2b型。用ELISA间接法测定小鼠腹水抗体效价为1：8000～1：128000。经免疫印迹试验证实5种单抗均能特异地识别rIFN－γ，其中1D5、3H9和1C11单抗对rIFN－γ具有中和活性，中和效价＞1：8000，用2种单抗建立的ELISA夹心法检测rIFN－γ，最低可测值为10．0ng／ml，且与白细胞介素－2，重组人α和β干扰素无交叉反应。     

轮状病毒低温传代后生物学特性的研究

本文报道了动物轮状病毒(RV)SA_(11)及 NCDV 株经低温传代后生物学特性变化。这两个毒株分别属动物 RV 第3和第6血清型。本实验室用非洲缘猴肾细胞(BGMK)作为基质,将两株病毒连续传代,选择起始温度36℃,每传10代降低3℃,最终在29℃传20代,总传代数为50代。低温传代后的毒株,血凝活性明显下降,对组织培养感染性在39℃时,冷适应株低于原始株,血清中和试验表明:传代后毒株抗原性稳定,SA_(11)株具有良好的遗传稳定性。NCDV 株在传代过程中第5基因片段发生变异。     

抗轮状病毒LLR株G10血清型特异性单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗轮状病毒(RV)LLR株G10血清型特异性单克隆抗体,并鉴定其特性。方法以纯化的RVLLR株(血清型为G10)为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术筛选分泌G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。采用层析法纯化单抗,常规免疫学方法鉴定单抗的特性。结果经筛选获得5G5、1H1和7F6共3株可稳定分泌高效价且具有G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。3株细胞分泌的单抗分别为IgG2a/κ、IgG2a/κ和IgG1/κ型;腹水效价均可达1.024×106;分别识别两个抗原位点;相对亲和力依次为1H1﹥7F6﹥5G5;5G5和1H1(细胞上清)均与G1～G4和G6血清型RV抗原无交叉反应;3株杂交瘤细胞分泌的单抗均识别相对分子质量约为34000的VP7蛋白,且均有不同程度的中和活性。结论已成功制备了抗RVLLR株G10血清型特异性单抗,该单抗可用于G10血清型RV的分型检测或LLR毒株的鉴别。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗生产毒株(SA_(14)-14-2)的稳定性研究

流行性乙型脑炎病毒弱毒株经原代地鼠肾细胞连续传至17代后,毒株蚀斑形态与低代次毒株相似,均为一致的小斑,直径为1mm士,边缘整齐;高代次毒株对成龄小鼠的神经内和神经外毒力未发现增高现象;乳鼠脑内返传一代和返祖试验均未发现高代次较低代次毒力明显升高;不同抗原性的单克隆抗体在与低代和高代次弱毒株的免疫荧光反应中未发现抗原位点变化。