伤寒Vi多糖柱层析纯化工艺的优化

目的优化伤寒Vi多糖柱层析纯化工艺,以替代传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法。方法采用DEAE离子交换层析柱,分别在缓冲液(20 mmol/L Tris-Cl)pH值为6.0、7.0和8.0的条件下纯化1批伤寒Vi多糖粗糖,并与传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法进行比较。按《中国药典》三部(2010版)要求检测纯化样品的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大小及内毒素含量,并计算样品的多糖回收率。采用优化的DEAE柱层析纯化工艺纯化3批伤寒Vi多糖粗糖,验证该工艺的稳定性。结果 DEAE离子交换柱缓冲液(20 mmol/L Tris-Cl)pH值为7.0和8.0时,可有效将伤寒Vi多糖的杂质与纯化产物分离,多糖回收率分别为36.52%和38.35%,明显高于传统工艺的多糖回收率(15.52%),且纯化产物的内毒素含量(10 EU/μg)明显低于传统工艺(200 EU/μg)。以优化工艺(pH 7.0)纯化3批伤寒Vi多糖粗糖获得的6批精糖的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大小、内毒素含量及多糖回收率差异较小,标准偏差均小于5%。结论优化了伤寒Vi多糖柱层析的纯化工艺,该工艺稳定性良好,可替代传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法,应用于伤寒Vi多糖的纯化。     

伤寒Vi多糖原液及疫苗的稳定性

目的　观察伤寒Vi多糖原液及其疫苗的稳定性。方法　将多糖原液和疫苗分别放不同温度下 ,并于不同时间取样测KD≤ 0 .2 5时多糖的回收率。结果　原液放 - 2 0℃以下保存 6年后 ,多糖回收率与放置前基本相同 ,均 >5 0 % ;疫苗放 2～ 8℃保存 47个月多糖回收率与放置前基本相同 ,均 >5 0 % ;疫苗放 37℃ ,可保存 40天。结论　伤寒Vi多糖原液和疫苗均具有良好的稳定性     

伤寒Vi多糖疫苗的接种反应及其免疫效果

目的观察伤寒Vi多糖疫苗的接种反应及免疫效果。方法采用随机、双盲、对照设计的原则,评价观察组和对照组疫苗接种后的反应发生率、抗体阳转率和抗体几何平均滴度(GMT)。结果疫苗接种后观察组和对照组全身反应总发生率分别为2.04%(11/540)和2.59%(7/270),均为轻度反应;局部反应发生率分别为3.52%(19/540)和4.07%(11/270)。伤寒Vi抗体阳转率分别为88.37%和85.46%,GMT分别为1∶134.31和1∶125.40,两者差异均无显著意义。结论伤寒Vi多糖疫苗在5岁以上人群接种后反应率低,免疫效果好。     

我国伤寒Vi多糖疫苗的质量检定及多糖含量检测的趋势分析

<正>1.概述伤寒是由伤寒沙门菌感染引起的急性全身性传染病,通过粪-口途径传播,其临床特征为持续发热、神经系统中毒症状、肝脾肿大及白细胞减少等,少数可并发肠出血及肠穿孔。人群对伤寒沙门菌普遍易感,但儿童和青壮年发病率最高。伤寒是发展中     

伤寒Vi多糖菌苗的安全性和免疫效果研究

对我国首次研究成功的伤寒Vi多糖菌酋进行了人体接种安全性、反应性、血清学效果和流行病学效果观察,各期观察达21万余人,结果证实伤寒Vi多糖茵茵安全世良好,反应轻微。血清学效果显示,30μg一次免疫,Vi抗体4倍增长可达91．6％。两次流行病学效果考核,按血培养伤寒杆菌阳性病例统计,保护率可达70％左右,茵茵的效果指数为3．29～3．49。该菌苗性质稳定,初免只需注射一针,替代现行菌体菌苗推广应用是完全可行的。     

伤寒杆菌Vi多糖疫苗中试研究

采用大罐培养Vi+疗伤寒Ty2菌株，连续流离心去除菌体，加Cetavlon沉淀多糖，NaCl溶解脱聚，去除核酸、蛋白，透析，乙醇沉淀多糖。经全面检定各项指标均达到或超过WHO规程要求，并建立了切实可行的中试生产工艺。     

人血清中抗伤寒Vi多糖特异IgG抗体含量ELISA检测方法的建立及验证

目的建立测定人血清中抗伤寒Vi多糖特异Ig G抗体含量的ELISA方法,并进行验证。方法以美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)测定Vi抗体的ELISA方法为主要参考,对包被抗原、不同吸附力酶标板、抗原包被浓度、样品反应条件、显色时间进行优化,建立测定人血清中抗伤寒Vi多糖Ig G抗体含量的ELISA方法,并对建立的方法进行特异性、线性、准确性、精密度、最低检测限验证。结果优化的ELISA法为:以伤寒Vi多糖作为包被抗原,costar92592型酶标板作为检测酶标板,2.0μg/ml为抗原包被浓度,20~25℃过夜为样品的反应条件,在40~80 min内(A405值在1.8~2.5之间)终止显色。质控血清经不同含量多糖吸收后,抗体含量与多糖浓度具有明显的浓度依赖关系,多糖抑制率最高可达92%;血清稀释度与抗体含量存在负相关的线性关系,R2=0.999;本试验检测的质控血清抗体浓度为76.80 EU/ml,变异系数(CV)=8.55%,与美国NIH检测的数据(75 EU/ml,CV≤15%)一致性良好;该方法重复性(CV≤15%)及中间精密度(CV≤20%)均符合要求;最低检测限为0.78 EU/ml。结论建立了人血清中抗伤寒Vi多糖特异Ig G抗体含量ELISA检测方法,该方法特异性、线性、准确性、精密度良好,可快速、准确地检测人血清中抗伤寒Vi多糖Ig G抗体含量。     

伤寒Vi多糖与不同载体蛋白制备的结合物的特性分析

目的比较以白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)和重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,r EPA)为载体蛋白,分别与伤寒Vi多糖(typhoid Vi polysaccharide,STVi)偶联的结合物的理化特性、抗原性及免疫效应。方法分别以DT、r EPA为载体蛋白,以己二酰肼(adipyl dihydrazide,ADH)为连接剂,使Vi多糖与载体蛋白共价偶联制备多糖蛋白结合物STVi-DT和STVi-r EPA,检测其理化特性指标、抗原性,再将其于0、14、28 d免疫NIH小鼠,经眼眶采血,分离血清,采用间接ELISA法检测小鼠血清抗体水平,分析其免疫原性、免疫记忆效应及免疫持久性。结果 STVi-DT、STVi-r EPA理化特性指标相似。STVi-DT针对STVi、DT抗血清均具有明显抗原性,而针对r EPA抗血清无抗原性,STVi-r EPA针对STVi、r EPA抗血清均具有明显抗原性,而针对DT抗血清无抗原性。Vi多糖和Vi多糖蛋白结合物均具有动物免疫原性,STVi蛋白结合物较STVi具有更强的免疫原性,STVi-DT的动物免疫原性试验结果略优于STVi-r EPA;免疫2剂STVi-DT和STVi-r EPA后,小鼠血清GMT明显升高,且STViDT组明显高于STVi-r EPA组(P0.05),具有较强的免疫记忆效应;免疫STVi-DT和STVi-r EPA后,小鼠血清GMT随免疫剂次增加和时间延长持续升高,直至稳定在一定水平,免疫持久性较好。结论 STVi-DT、STVi-r EPA理化特性相似,均具有显著的免疫原性、免疫记忆效应及免疫持久性,而STVi-DT免疫原性、免疫记忆效应更强。     

伤寒Vi荚膜多糖菌苗的研究

Robbins等人证实:用不变性方法提纯的伤寒沙门氏菌荚膜多糖(Vi抗原)不仅有抗原性,且对伤寒沙门氏毒菌攻击具有保护作用。我们用不变性方法提纯了Vi抗原并对其化学和生物学特性进行了检定,初步证实了Robbins Vi抗原具有保护作用的意见,用0.5～1.0μg提纯的Vi抗原免疫,对Vi~+的伤寒沙门氏毒菌菌株的攻击可提供高度防御作用。     

伤寒-鼠伤寒基因重组菌株Vi4072与伤寒Ty2株和枸橼酸杆菌的Vi抗原比较

将来源于枸橼酸杆菌编码产生Vi抗原的ViaB基因片段,通过基因重组技术引入减毒的鼠伤寒杆菌而组建的Vi4072重组株与伤寒沙门氏菌Ty2株和枸橼酸杆菌的Vi抗原,通过琼脂双向扩散试验、被动血凝试验、对BALB/c小鼠的免疫力试验以及对Vi抗原分子的化学元素含量、红外光谱、超导核磁C谱、H谱分析测试。结果表明上述三种菌株产生的Vi抗原其血清学特性、免疫保护作用及化学分子结构等基本相同。且Vi4072重组株表达Vi抗原量高于伤寒Ty2株。     

包被伤寒Vi多糖抗原检测鼠血清中伤寒沙门菌抗体的间接ELISA方法的建立

目的建立检测伤寒沙门菌(Salmonella typhi)抗体的间接ELISA方法,并进行验证。方法对常规间接ELISA方法进行优化,确定抗原最适包被质量浓度及被检血清最佳稀释度、最适包被温度及时间、包被抗原与血清的最适温度和时间、血清与酶标二抗及封闭的最适温度和时间、酶标二抗最适工作质量浓度,并验证该方法的灵敏度、精密性、特异性及耐用性;用伤寒Vi多糖结合物原液和伤寒Vi多糖衍生物经小鼠大腿内侧皮下免疫,分别于免疫后第14、21、28、35天,经眼眶采全血,分离血清,应用建立的间接ELISA方法检测抗体水平,计算抗体几何平均滴度(GMT)。结果确定了间接ELISA方法最适工作条件:伤寒Vi荚膜多糖抗原最适包被质量浓度为5μg/ml,血清最佳稀释倍数为1∶40;最适包被温度及时间为4℃12 h;包被抗原与血清最适反应温度和时间为37℃2 h;血清与酶标二抗最适反应温度和时间为37℃1 h;封闭液最适封闭温度和时间为室温1 h;HRP标记的羊抗鼠IgG最佳反应浓度为1∶8 000。该方法灵敏度为1∶1 600;孔间和板间CV平均值分别为2.8%和5.8%;与其他血清无交叉反应;pH值、包被时间、包被温度及酶结合时间调整前后,同一样品检测的A450值差异无统计学意义(P0.05)。伤寒Vi多糖与蛋白载体偶联后,免疫原性明显增强,且白喉类毒素(diphtheria toxin DT)和重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinantPseudomonasaeruginosaexotoxinA,rEPA)两种不同载体偶联得到的结合物免疫原性无明显差异。结论成功建立了一种检测伤寒沙门菌抗体的间接ELISA方法,该方法具有较强的特异性、灵敏度及精密性。     

生物多糖代谢产物的调控过程优化研究

研究了CICC10258菌代谢生物多糖黄原胶的能力,考察了发酵培养基中不同碳源、氮源、无杌盐以及起始 pH对最终发酵液粘度的影响,确定了发酵培养基的优化配方[g·(100 mL)-1]:玉米淀粉5、(NH4)2SO4 0．3、CaCO3 0．2、MgSO4 0．08、K2HPO4 0．2,起始pH 8．0。探讨了发酵温度、时间、接种量等发酵条件对发酵的影响。     

应用火箭电泳法测定伤寒Vi菌苗中的多糖浓度

伤寒Vi多糖菌苗在我国已试制成功，为了控制该茵苗的生产质量，必须建立一些实用的检定方法。由于Vi多精对酸水解有抗性和Vi单糖中存在氨基和按基基团，常用的比色法不适用于伤寒Vi多糖的测定。因此WHO规程中推荐使用火箭电泳法。用火箭电泳法检测多糖的浓度和分子大小国外已有     

鸡腿菇中可溶性多糖提取条件优化

以鸡腿菇为原料,采用水溶剂提取法对其所含的可溶性多糖的提取条件进行研究。实验结果表明:提取温度,料液比,提取时间和提取次数对鸡腿菇中多糖的提取均有较大的影响,通过正交实验法得到可溶性多糖提取的最佳条件:温度70℃、料液比1∶40、提取时间4 h、提取次数3次。     

硫酸酯化多糖提取工艺优化

对硫酸酯化多糖的提取工艺条件进行了优选研究并对产品进行了鉴别实验.确定了提取时间为2 h、提取温度90℃、加水量为干净海藻的25倍的最佳条件,产率达到1.99%,主要理化指标"硫酸根 多糖"含量为61.26%.     

槲蕨中水溶性多糖提取条件的优化

以水为提取剂,提取槲蕨中的水溶性多糖.分别考察了提取温度、提取次数、提取时间、料液比4个因素对水溶性多糖提取率的影响.实验结果表明,槲蕨中水溶性多糖的最佳提取工艺为：温度60℃、料液比1∶50、提取次数3次、浸提时间90min.     

植物蛋白胨培养基在23价肺炎球菌多糖疫苗生产中的应用

目的对植物蛋白胨培养基应用于23价肺炎球菌多糖疫苗规模化生产的效果进行初步评价。方法采用植物蛋白胨培养基,按生产规模进行肺炎球菌发酵培养和分离纯化多糖,检测大罐培养浓度、培养液多糖含量及精制多糖各项质量指标,并与现有23价肺炎球菌多糖疫苗生产用动物蛋白胨培养基相比较。结果与动物蛋白胨培养基相比较,使用植物蛋白胨培养基可提高肺炎球菌大罐培养浓度以及培养液多糖含量;精制多糖收率明显提高,各项质量指标均符合企业注册标准要求。结论在生产规模下,使用植物蛋白胨培养基生产的肺炎球菌精制多糖质量符合企业注册标准,且可较大幅度地提高精制多糖收率,为植物蛋白胨培养基应用于23价肺炎球菌多糖疫苗规模化生产奠定了基础。     

Box-Benhnken组合法优化长萼堇菜多糖提取工艺

目的对提取时间、提取温度和提取次数三个因素进行优化实验,研究长萼堇菜多糖提取工艺;方法通过水提醇沉法提取长萼堇菜多糖,并使用响应面法在单因素实验基础上进行Box-Benhnken组合实验;结果通过响应面法拟合回归方程,确定长萼堇菜多糖最佳提取工艺:温度为100oC,提取次数2次,时间为4 h时,多糖得率理论最优值为5.51%;结论经过实验验证最优提取条件,得到实际的平均多糖得率为5.29%,与拟合的数学模型5.51%近似,证明该模型具有可行性,得到了长萼堇菜多糖较佳的提取工艺。     

多糖改性细菌纤维素的制备

合成细菌纤维素时向培养基中添加了海藻酸钠、羧甲基纤维素、羧甲基壳聚糖等多糖,制备出了性能更优异的改性细菌纤维素。采用红外光谱和扫描电镜对所得产物进行表征,并测试了合成纤维素的产量、湿膜含水量以及对金属离子的吸附性能。     

培养基和生长周期对平菇多糖含量的影响

通过对浸提温度、浸提时间、液料比和醇沉浓度的考察,确定了平菇中多糖的最佳提取工艺,在此基础上,对实验室六种培养基、两个生产周期的平菇进行了多糖含量变化的研究。结果表明：最佳浸提温度为90℃、浸提时间3h、液料比30：1、醇沉浓度90％;平菇中多糖的含量随培养基中棉籽壳与秸秆的比例的增大而增大：随着生产周期的延长、培养綦的营养成分减少,平菇中多糖的含量也随之降低：与市售平菇相比,实验室2号培养基、第二周期培养出的平菇,其多糖含量也比市售的高,说明实验室培养基种植的平姑其多糖含量更丰富。