大肠杆菌重组人成骨蛋白-1的非诱导表达特性

目的　研究大肠杆菌重组人成骨蛋白 1的非诱导表达特性。方法　通过水质、起始pH、接种量、葡萄糖添加量、甘油添加量、装液量、转速等实验研究不同营养条件和培养条件对OP 1非诱导表达的影响。通过传代实验 ,考察该系统OP 1表达的稳定性。结果　水质对OP 1的表达没有明显影响 ,2 %～ 4 %的接种量有利于OP 1的表达 ,起始pH以 6 0为宜。葡萄糖对OP 1的表达有较大影响 ,2 %～ 4 %的葡萄糖添加量可以获得较高表达。甘油的添加能明显促进OP 1的表达 ,最适添加量为 0 3% ,较对照提高表达 81 7%。该表达系统对溶氧的需求不大 ,装液量和转速分别以 12 5～ 15 0ml和 15 0r min为宜。在优化条件下 ,最适表达时间为 2 4～ 2 6h ,OP 1的表达量可达到菌体蛋白的 4 0 %。优化的营养条件和培养条件对本系统OP 1的表达和质粒的稳定有利 ,10次传代可保持 90 %表达。结论　建立了非诱导表达的摇瓶发酵工艺 ,对其非诱导表达特性有了较为深入的了解 ,为进一步放大研究奠定了基础。     

重组人成骨蛋白-1复性条件的优化

目的优化重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)包涵体蛋白的复性条件。方法将表达rhOP-1的大肠杆菌菌体在冰浴下超声裂解,分离提取包涵体,用8mol/L尿素溶解,纯化后进行梯度透析复性。利用TotalLab软件分析目的蛋白二聚体的含量,用体内法和体外法测定其生物学活性。结果经纯化后,目的蛋白纯度达97%以上。最佳复性条件为4℃,pH9.0,蛋白浓度为0.4～0.8mg/ml,尿素浓度为2mol/L,L-Arg浓度为0.4mol/L;目的蛋白复性率达75%以上,复性后蛋白具有较高的生物学活性。结论已确定了rhOP-1包涵体梯度透析复性的最佳条件。     

可溶性重组人成骨蛋白-1的制备

目的制备可溶性重组人成骨蛋白-1(rhOP-1),并尝试制备注射制剂。方法rhOP-1工程菌经发酵表达,收集菌体,提取包涵体,用SP-FF阳离子层析柱纯化。取纯度达95%以上的rhOP-1蛋白,透析复性,加入L-精氨酸作为复性助溶剂,制备成冻干粉末,以不加助溶剂的rhOP-1为对照。将制备的冻干粉末复溶后,观察rhOP-1溶解性,并检测其活性。结果复性液中加入L-精氨酸的复性rhOP-1蛋白浓度为0.5mg/ml,回收率可达60%,冻干粉末复溶后,溶解性及rhOP-1活性良好。结论用此复性方法制备的rhOP-1溶液作为注射剂,有较好的应用前景。     

小鼠MUC1基因的克隆及其在大肠杆菌DH5α中的表达

目的构建表达小鼠MUC1基因的工程菌,并纯化重组小鼠MUC1融合蛋白。方法通过RT-PCR扩增小鼠MUC1基因片段,连入pMAL-p2原核表达载体,并转化大肠杆菌DH5,αIPTG诱导表达,经Western blot鉴定,Amylose Resin亲和层析纯化。结果获得了小鼠MUC1 708bp DNA片段,并构建了pMAL-mMUC1表达载体。表达产物相对分子质量约为67000,经Western blot鉴定,与兔抗MBP多克隆抗体产生特异性反应。纯化的融合蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带。结论成功构建了表达小鼠MUC1蛋白的工程菌。     

重组人骨形态发生蛋白-2的制备及成骨活性表征

骨形态发生蛋白-2(BMP-2)是重要的骨诱导生长因子,是提高骨修复材料活性和临床骨修复效果的有效手段和关键物质。由于BMP-2在体内含量低,依靠从动物体内提取难以满足临床需求。本文研究满足临床需求的BMP-2的制备方法,并评价其生物活性。采用密码子优化方法,并通过进一步更换其中部分核苷酸编码,得到优化的hBMP-2基因的DNA序列,制备大肠杆菌rhBMP-2菌株,通过发酵及工艺优化,获得BMP包涵体,经分离纯化与复性,制备出高纯度的rhBMP-2。测定C2C12细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性来表征单倍体和二倍体BMP-2的成骨活性,发现二倍体rhBMP-2的成骨活性明显高于单倍体rhBMP-2,并且随着BMP-2浓度增加,碱性磷酸酶活性上升。体内动物异位成骨实验发现rhBMP-2肌带植入小鼠体内3周后,取出的异位骨颗粒鲜艳饱满,骨结构完整;HE切片和Masson三色切片都显示出良好的异位成骨效果。此方法制备的rhBMP-2具有良好的诱导成骨分化能力,可用于骨组织修复,满足临床需要。     

重组人骨形成蛋白-2的质量控制

目的建立重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)质控方法和质量标准。方法以小鼠体内异位成骨试验测定rhBMP-2的生物学活性,HPLC-SEC法测定纯度,蛋白N-末端测序仪测定N-末端15个氨基酸残基序列,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果1批rhBMP-2原液鉴定结果显示,样品比活性为5.9×104BU/mg,纯度为97.6%,N-末端序列为(MKR)LKSSCKRHPLYV,其余项目检测结果均符合《中国药典》三部(2005版)的要求。结论该质控标准可用于rhBMP-2产品的常规检定。     

人热休克蛋白70基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆人热休克蛋白70(HSP70)基因,构建其原核高效表达载体。方法将PCR扩增的HSP70基因克隆到原核高效表达载体pET-28b中,转化大肠杆菌JM109。挑选阳性克隆,提取质粒pE28b70F,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达目标蛋白。结果在大肠杆菌中成功表达了HSP70,表达量约占细菌总蛋白的22·3%,其中可溶性目标蛋白占上清总蛋白的12%。Westernblot表明该目标蛋白具有与鼠抗人HSP70单抗特异结合的抗原活性。通过Ni2+-NTA亲和柱,从1L诱导产物中纯化出约1520mg重组蛋白,纯度在80%以上。结论已成功表达HSP70,为进一步研究其生物学功能和作用机制奠定了基础。     

人重组酸性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的表达及鉴定

利用逆转录-DNA聚合酶链式反应，从体外传代培养的人肺成纤维细胞中钓出人酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）全编码区的cDNA，将其克隆人pKK223-质粒，在大肠杆菌JM105中高效表达出人重组aFGF。此aFGF经Heparin－Sepharose纯化后，表现了很好的生物学活性。     

人体β-防御素-3突变基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的对人体β-防御素-3基因进行定点突变,并在E.coli中表达。方法从人正常皮肤组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码β-防御素-3成熟肽的cDNA,测序正确后,设计含突变位点的引物,用PCR重叠延伸法对β-防御素-3成熟肽cDNA进行定点突变,将突变产物克隆至pUC18,并在E.coli中融合表达。结果测序结果表明,经RT-PCR所得的β-防御素-3成熟肽序列与GenBank中报道的序列完全一致。经过突变,β-防御素-3成熟肽第29位谷氨酰胺密码子由CAG突变为精氨酸密码子CGA,其余核苷酸序列均未发生变化。将突变β-防御素-3基因在E.coli中诱导表达后,可见突变β-防御素-3蛋白表达。结论已成功克隆并表达了β-防御素-3突变体基因。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

根据GenBank报道的黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因序列设计两对特异性引物,分别以黑曲霉H7总RNA及基因组DNA为模板,扩增出β-葡萄糖苷酶基因bgl全长及活性中心所在的外显子5序列E5,分别将其连接到pMD18-T载体并转化到大肠杆菌DH5α测序。结果表明,bgl序列全长2583 bp,与β-葡萄糖苷酶基因(XM001398779.1)核苷酸序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为99%,E5与bgl外显子5区域同源性为100%。进一步构建表达质粒pET32a(+)-bgl、pET32a(+)-E5、pET28a(+)-E5,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳分析。     

人巨细胞病毒gp52蛋白基因片段的克隆及表达

目的为获得高表达人巨细胞病毒 ｇｐ５２蛋白基因的工程菌。方法通过计算机分析,筛选出巨细 胞病毒蛋白ｇｐ５２中优势抗原决定簇,用ＰＣＲ技术扩增克隆了含强抗原决定簇的基因片段。将克隆的基因片段插 入表达载体ｐＥＴ２８（ａ）内,转化大肠杆菌ＢＬ２１,经Ｓｅｐｈａｒｅｒｙ１ Ｓ－２００分子筛及Ｎｉ－ＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ螯合层析进行纯化。结 果获得的工程菌所表达的 ｇｐ５２蛋白片段相对分子质量约为 ２１ ０００,约占菌体可溶性蛋白的 ２８％。获得的表达蛋 白纯度达９５％,电泳显示单一条蛋白带,ＥＬＩＳＡ分析证实有较强的抗原性和较好的特异性。结论本研究对人巨细 胞病毒感染,尤其是对孕妇及献血员等感染的检测有重要意义。     

人白细胞介素18的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的　在大肠杆菌中高效表达IL 18。方法　从人外周血中提取RNA ,用RT -PCR方法得到IL 18的cDNA ,双酶切将其插入pET 2 3(b) + 载体中 ,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性菌落 ,提取质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达。结果　所获得人IL 18克隆 ,经测序与GenBank报道的完全一致。所表达的产物经SDS -PAGE显示在相对分子质量 2 0 0 0 0处出现一条特殊条带 ,与预期的分子量一致。结论　已成功获得了人IL 18克隆并在大肠杆菌中表达     

HIV-1 Vif基因的克隆与原核表达

目的克隆HIV-1Vif基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法构建原核表达载体pMRI,将Vif基因序列克隆至该载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,菌体裂解后获得特异性表达蛋白,用组氨酸标签特异性亲和树脂分离纯化该蛋白,并经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果表达质粒pMRI-Vif经双酶切,可见约600bp的Vif基因片段,测序结果证明质粒构建正确。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了可溶性Vif蛋白,纯化后经凝胶自动扫描分析,纯度达85%以上,蛋白浓度约为1g/L。纯化产物具有良好的抗原特异性。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性Vif蛋白。     

人血管生成抑制素基因的克隆、表达及纯化

目的 构建携带人血管生成抑制素基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的血管生成抑制素。方法 用PCR法从人纤溶酶原cDNA中扩增出Kringle 1-3基因,克隆入pET21a(+)载体中,在大肠杆菌BL 21中表达,表达产物经亲和层析纯化。结果 所构建的原核表达载体为高效表达系统,所表达的产物经层析纯化后可获得重组人血管生成抑制素。结论 可获得大量纯化人血管生成抑制素,为进一步临床应用奠定基础。     

生长抑素(SS)基因在大肠杆菌pT7ZZ表达系统中的克隆与表达

目的 构建和筛选既能稳定、高效表达SS融合蛋白，又能使这种融合蛋白保持良好的SS抗原性和高水溶性等特点的重组质粒。方法 用 BamH I/Xho I (B/X）和 BamH I/EcoR I（B/E）双酶切，将含有SS基因的片段由pThioHis A中切出，然后分别克隆到 pT7ZZa中的相应酶切位点，得到pSSB/X（短尾）和pSS-B/E(长尾)两个重组质粒，用常规表达技术在大肠杆菌中对其进行表达。结果 pSS-B/X和pSS-B/E两个重组质粒在宿主菌BL21（DE3）中均获得表达，pSS-B/X获得高效表达后融合蛋白占菌体总蛋白的30．6％。两个表达菌经超声裂解后电泳发现，SS－B/X－ZZ和SS－B/E－ZZ这两种融合蛋白基本为可溶性蛋白，沉淀中含量极低。二者均具有良好的抗原性，结论pSS-B/X重组质粒很有希望成为SS基因疫苗的候选质粒。     

人乳头瘤病毒16型L1/E7嵌合基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的克隆人乳头状瘤病毒16型(HPV16)L1/E7嵌合蛋白基因,并在毕赤酵母中表达。方法PCR扩增HPV16L1/E7基因,并克隆至毕赤酵母表达载体pPIC-3·5K和pPIC-9K中,构建含HPV16L1/E7基因的pPIC3·5K-HPV16L1/E7和pPIC9K-HPV16L1/E7重组表达载体,经测序证实插入的外源基因读码框正确后,分别转入GS115和KM71菌株中,筛选阳性转化菌株,经PCR鉴定,甲醇诱导表达HPV16L1/E7嵌合蛋白,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定,电镜观察,并经离心法纯化VLPs。结果HPV16L1/E7基因已成功插入pPIC-3·5K和pPIC-9K载体中,共获得6株KM71HPV16L1/E7-pPIC3·5K、5株GS115HPV16L1/E7-pPIC3·5K、1株KM71HPV16L1/E7-pPIC9K和2株GS115HPV16L1/E7-pPIC9K阳性转化菌株,并可表达相对分子质量约为69000的蛋白,与预期值一致。表达量约为0·35~1·04mg/ml。Westernblot显示该蛋白可与抗-HPV16L1蛋白和抗-HPV16E7蛋白的单克隆抗体特异性结合。在透射电镜下可观察到VLPs的形成,其形态与HPV16天然病毒颗粒相似。经纯化的目的蛋白纯度接近100%。结论已成功构建了pPIC3·5K-HPV16L1/E7和pPIC9K-HPV16L1/E7重组表达载体,阳性转化菌株可表达结构与野生型HPV16一致的VLPs。