重组人粒细胞刺激因子生物学活性国家标准品的制备及协作标定

目的 制备重组人粒细胞刺激因子(recombinant humna granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)生物学活性国家标准品,并进行协作标定.方法 rhG-CSF原液中加入冻干保护剂制备待标品,进行外观、无菌检查及水分、生物学活性检测.将待标品置-20、4、25、...     

冻存对复溶后人粒细胞刺激因子国家标准品生物学活性的影响

目的 探讨冻存对复溶后人粒细胞刺激因子（human granulocyte colony-stimulating factor,hG-CSF）国家标准品生物学活性的影响,为hG-CSF国家标准品的使用提供参考。方法 依据《中国药典》三部（2020版）通则3525测定标准品的生物学活性;将复溶后的hG-CSF国家标准品分装后置于-80、-40、-20℃保存,分别于第1、2、3、5和6个月取样检测生物学活性,用临用前复溶的标准品定量-80℃存放不同时间的标准品,以-80℃存放的样品为100%活性对照品定量其余样品的相对生物学活性。结果 热加速稳定试验拟合Eyrlng方程为：ln{k(t)}=6.75-3 772.20/T+ln(T),R2=0.969,预测hG-CSF国家标准品于-80℃贮存时,生物学活性衰减5%约需93.4个月;-80℃冻存的复溶标准品生物学活性值下降约24%。结论 hG-CSF国家标准品复溶分装后于-80℃可稳定保存半年以上。但冻融会引起活性值下降超过20%,因此不建议复溶后分装储存使用。     

首批重组人干扰素α2b活性测定国家标准品的研制

目的研制首批重组人干扰素α2b(rhIFNα2b)活性测定国家标准品。方法按《中国药典》三部(2010版)相关要求,进行rhIFNα2b活性测定标准品的制备、检验,以rhIFNα2b国际标准品为标准进行协作标定,并使用热加速试验进行稳定性考察。结果制备的rhIFNα2b活性测定标准品外观、无菌检查合格,水分含量为0.6%,分装精度为0.3%;经5个实验室协作标定共25次,几何平均生物学活性为4.27×105 IU/支,平均生物学活性的95%置信区间为4.13×105~4.42×105 IU/支,单次测定的95%参考值范围为3.65×105~5.00×105 IU/支,平均可信限率为3.32%;在-20℃下,生物学活性降低10%需19.6年,稳定性较高。结论该批rhIFNα2b活性测定标准品各项指标均符合《中国药典》三部(2010版)相关要求,已被批准为国家标准品,规格为:4.27×105 IU/支。     

重组人干扰素β1b活性测定国家标准品的研制

目的研制重组人干扰素β1b(rhIFNβ1b)生物学活性测定国家标准品。方法按《中国药典》三部(2005版)要求检测rhIFNβ1b标准品原液各项质量指标,以rhIFNβ1b国际标准品为标准进行协作标定,并检测其稳定性。结果rhIFNβ1b国家标准品经检测,外观、无菌试验合格,水分含量为0.8%,分装精度为0.44%。该标准品经3家实验室协作标定24次,几何平均生物学活性为7.18×104IU/支,平均生物学活性的95%可信区间为6.87×104～7.52×104IU/支,单次测定的95%参考值范围为5.76×104～8.68×104IU/支,平均可信限率为4.36%。在温度为-20、4、25和37℃条件下放置12个月,其生物学活性保持稳定。结论该批rhIFNβ1b活性测定国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品使用,生物学活性定为7.2×104IU/支,批号为08/01。     

重组人粒细胞集落刺激因子的生物学活性分析

目的评价近年重组人粒细胞集落刺激因子(Recombinant human grenulocyte colony-stimulatiny factor,rhG-CSF)的生物学活性及其检测方法的应用情况。方法采用mNFS-60细胞/MTT比色法对41批不同来源的rhG-CSF进行生物学活性检测,对中国食品药品检定研究院与各生产企业的检测结果进行比较,评价中国食品药品检定研究院检测rhG-CSF生物学活性结果的可信性。结果 37批国产rhG-CSF的生物学活性检测结果均符合《中国药典》三部(2010版)质量要求,4批进口rhG-CSF的生物学活性均符合进口拟定质量标准(JS20070016)要求。中国食品药品检定研究院与各企业的rhG-CSF生物学活性检测结果差异均无统计学意义(P>0.05)。结论近年上市的rhG-CSF生物学活性达到《中国药典》三部(2010版)质量要求;该制品的生物学活性检测方法在全国范围内应用情况良好。     

重组人表皮生长因子生物活性国家标准品的研制

【摘 要】目的 建立测定重组人表皮生长因子（rhEGF）活性用国家标准品。方法 按WHO有关要求，制备并检测标准品，以EGF国际标准品为标准进行协作标定。结果 冻干EGF标准品经外观、无菌、水分检测均符合规定，在-20、4、25和37℃保持33个月生物活性稳定，协作标定几何平均效价为6823IU/支。实验均数的95％可信区间为5958～7812IU/支，单次实验的95％参考值范围为2241～12056IU/支，平均可信限率为14．64％。结论 该批EGF标准品可作为国家标准品，效价定为6800IU/支，批号为97/01。     

重组人粒细胞集落刺激因子的氨基酸组成分析

目的分析重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的氨基酸组成。方法应用氨基酸分析仪,采用离子交换色谱茚三酮柱后衍生法对rhG-CSF进行氨基酸组成分析。样品采用常规酸水解处理后,以氨基酸标准溶液外标法进行测定。结果系统对标准溶液各个氨基酸组分均有良好的分离。3支rhG-CSF样品的9次测定结果除Met外,均较接近,变异系数较小,与理论值基本一致。结论采用氨基酸自动分析仪柱后衍生法分析氨基酸组成重复性好,误差较小,可用于rhG-CSF的质量控制。     

重组人粒细胞刺激因子注射液比活性的对比分析

目的评估国产重组人粒细胞刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)注射液比活性的总体水平。方法收集2009及2017年国家抽验性评价部分批次rhG-CSF样品的比活性数据,并与近5年进口注册检验部分批次rhG-CSF样品进行比较分析。结果 2009部分批次rhG-CSF样品比活性均值为0. 74×10⁸IU/mg,标准差为0. 10×10⁸IU/mg;2017部分批次rhG-CSF样品比活性均值为0. 83×10⁸IU/mg,标准差为0. 15×10⁸IU/mg;进口注册批次比活性数据的均值为0. 93×10⁸IU/mg,标准差为0. 17×10⁸IU/mg。结论国产rhG-CSF注射液质量不断提升,与进口制品间的差距在逐渐缩小,部分企业制品的质量已达到进口药品水平。     

重组牛碱笥成纤维细胞生长因子国家标准品的研制

目的 建立效价测定用的重组牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）国家标准品。方法 按WHO有关要求制备标准品,分装、冻干后进行,以bFGF国际标准品为标准进行协作标定。结果 经验测外观、无菌实验合格,水分为0.99%,于－20、4和25℃条件下放置3个月其生物活性稳定。该标准品经3家实验室协作标定,共23次测定,平均效价为6971 IU／支。实验均数的95％可信区间为6266－7753 IU／支,单次实验的95％参考值范围为3394－10965IU／支,平均可信限率为10.995%。结论 该批重组牛bFGF国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品使用,效价定为7000IU／支,批号为01／96。     

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子生物学活性测定TF-1细胞/MTT比色法的优化及其验证

目的对检测重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor,rh GM-CSF)生物学活性的TF-1细胞/MTT比色法进行优化及验证。方法以rh GM-CSF依赖细胞株TF-1为靶细胞,采用MTT比色法测定rh GM-CSF生物学活性,对比色法中裂解液种类、裂解时间、细胞浓度、MTT作用时间等进行优化,并对优化后的方法进行准确度和精密度验证。结果优化后的TF-1细胞/MTT比色法:将供试品及标准品稀释至18 IU/ml,做2倍系列稀释,共8个稀释度,50μl/孔;加入6×10~5个/ml TF-1细胞悬液,50μl/孔,37℃培养48~52 h;加入MTT溶液,20μl/孔,37℃培养5 h;加入15%SDS裂解液,150μl/孔,裂解过夜,检测A570值。3种不同浓度的rh GM-CSF标准品活性测定结果回收率为104%;rh GM-CSF标准品6次检测活性平均值为18.6 IU/ml,变异系数为5.37%;rh GM-CSF标准品3 d活性检测结果的平均变异系数为5.18%。结论采用优化后MTT比色法检测rh GM-CSF生物学活性,准确度和精密度均较高,可应用于rh GM-CSF活性的检测。     

重组人血白蛋白蛋白质含量RS20国家标准品的研制

目的 制备重组人血白蛋白蛋白质含量RS20国家标准品,用于重组人血白蛋白产品的质量控制.方法 以重组人血白蛋白为原料,经灭菌注射用水稀释、除菌过滤后,进行分装、冻干,制备重组人血白蛋白蛋白质含量RS20国家标准品.8家实验室采用凯氏定氮法进行协作标定,并检测标准品的分装误差、水分含量、均匀性及稳定性.结果 8家实验室测...     

聚乙二醇修饰重组人粒细胞集落刺激因子反应过程的优化

采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰重组人粒细胞集落刺激因子rhG CSF，考察了各因素对蛋白质平均修饰度及体外生物活性的影响，并对修饰产物的稳定保存条件进行了初步探讨. 通过四因素四水平正交法和单因素实验结合，优化修饰条件为：PEG与G CSF摩尔比为25:1, pH 7.6的硼酸盐缓冲环境，反应时间40 min，反应温度22℃. 在此条件下，PEG-G-CSF的平均修饰度为50%，活性可保留40%左右. 研究还发现，不同的添加剂影响PEG-G-CSF的保存稳定性，人血清白蛋白和甘露醇是两种效果最好的保护剂，在它们的存在下，PEG-G-CSF溶液在4℃放置一个月后活性保留92%，三个月后保留51%.     

重组链激酶(rSK)国家标准品的研制

目的　建立效价测定用重组链激酶国家标准品。方法　以NIBSC的国际标准品为标准 ,采用体外溶圈法 ,按WHO要求组织了 3家实验室 ,对该批rSK国家标准品 (批号 96 0 70 1)的效价进行协作标定。结果　经统计学分析 ,均数为 495IU/支 ,95 %可信区间为 45 7～ 5 35IU/支 ,单次测定的 95 %标准值范围为 30 1～ 70 6IU/支。该批国家标准品效价确定为 5 0 0IU/支。 4种不同温度存放 2 9个月的样品 ,效价稳定。结论　该批rSK效价稳定 ,可作为国家标准品。     

分泌型重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的纯化

GM－CSF工程菌W3100经发酵培养后，将菌体低渗裂解，经流水柱─分子筛─阴离子交换树脂的一系列层析，最后得到纯化的GM－CSF，其纯度为98％以上，比活性大于20×107。     

分泌性重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子药效研究

应用本所研制的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSF），按0．012和0．024mg／kg剂量静脉注射家犬可明显抗由环磷酰桉所致的白细胞减少和血小板减少；按0．075、0．15和0．3mg／kg剂量皮下注射经60Co照射致白细胞减少症的小且有明显恢复作用：增加脾细胞集落、外周血白细胞、骨髓有核细胞及巨噬细胞数。其药效强度与进口升白能近似。     

重组5型腺相关病毒基因组滴度测定用国家标准品的研制

目的 研制重组5型腺相关病毒(recombinant type 5 adeno-associated virus,rAAV5)基因组滴度测定用国家标准品。方法 对三质粒系统制备的rAAV5-GFP原液,按《中国药典》三部(2020版)相关要求进行鉴别、外观、pH、无菌、基因组滴度、纯度、感染滴度等检定,根据结果稀释、分装,制备成候选标准品;采用热加速试验对候选标准品进行稳定性考察;组织3家实验室,采用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)法对候选标准品进行协作标定。结果 候选标准品原液及候选标准品的各项检测指标均符合相关要求;在25、4、-20、-40、-80℃条件下,1、3、4、6个月基因组滴度均无明显下降;经3家实验室协作标定,候选标准品赋值为2.56×10¹²copies/mL,95%置信区间为2.48×1012～2.64×10¹²copies/mL。结论 研制的rAAV5基因组滴度测定用国家标准品具有良好的稳定性,可用于rAAV5相关产品的质量评价。     

表达人粒细胞集落刺激因子大肠杆菌的优化

通过对hG CSF重组基因表达效率和工程菌遗传稳定性的比较 ,建立的一种全新的双质粒双重诱导的原核高效表达体系。构建了pGP1 2 pJGW1 hGCSF DH5α工程菌 ,经 42℃热诱导 ,hG CSF的表达率达 2 7%以上 ,经典质粒遗传稳定性实验 (140代 )证实 ,具有良好的遗传稳定性。     

第一批重组人红细胞生成素国家标准品的研制

目的　建立符合国家标准品要求,用于重组人红细胞生成素（ｒＨｕＥＰＯ）质量控制的ｒＨｕＥＰＯ国家标 准品。方法 用英国 ＮＩＢＳＣ提供的 ＷＨＯ ｒＨｕＥＰＯ（８７／６８４）,采用经典的多血症小鼠－”Ｆｅ体内生物学活性测定法, 对我国第一批重组人红细胞生成素国家标准品（９８０５２８）进行了标定。用阿根廷ＩＮＳＴＴＴＵＴＯ　ＳＩＤＵＳ　Ｓ．Ａ．进行了复 核标定。结果 该批国家标准品效价为８２ＩＵ／瓶,生物学活性稳定。结论９８０５２８批ｒＨｕＥＰＯ可作为国家标准品, 用于重组红细胞生成素制品体内生物学活性测定。     

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子壳聚糖-海藻酸钠微囊的制备

目的以壳聚糖和海藻酸钠为原料,制备重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)微囊,探讨开发口服蛋白多肽类药物的可行性。方法以rhGM-CSF为药物模型,通过壳聚糖与海藻酸钠聚电解质的络合反应制备rhGM-CSF壳聚糖-海藻酸钠微囊,观察微囊的形态大小,测定其包封率,不同pH值下的膨胀度和体外释放率。结果制备的rhGM-CSF壳聚糖-海藻酸钠微囊呈均匀、完整的圆球形,平均直径1mm左右;包封率达80%以上;在模拟肠液(磷酸盐缓冲液,pH7.4)中浸泡3h,膨胀度可达600%,药物释放率达85%以上。结论壳聚糖-海藻酸钠微囊具有肠溶控释作用,有望成为rhGM-CSF等蛋白类口服药物的控释载体。     

重组人粒细胞集落刺激因子预防恶性肿瘤患者化疗期感染的效果

目的　观察重组人粒细胞集落刺激因子预防恶性肿瘤患者化疗期感染的效果。方法　分析 67例(112例次 )小细胞肺癌、非小细胞肺癌和肠癌患者化疗期辅用或不辅用重组人粒细胞集落刺激因子的感染情况。结果　 2组患者化疗期感染 40例次 (感染率 3 5 .7% ) ,其中非重组人粒细胞集落刺激因子组 (5 0 .0 % )是重组人粒细胞集落刺激因子组 (2 6.5 % )的近两倍 ,在不同性别、年龄和临床分期方面 ,重组人粒细胞集落刺激因子组患者感染率只有男性组明显低于非重组人粒细胞集落刺激因子组。但 2组感染后治疗效果差异无显著性意义。结论　重组人粒细胞集落刺激因子可明显减少恶性肿瘤患者化疗期感染的机会 ,从而使其所导致的死亡率降低。同时可缩短患者住院时间 ,减少住院费用 ,提高患者的生活质量