慢性粒细胞白血病树突状细胞对T细胞增殖作用的研究

目的　体外诱导慢性粒细胞白血病 (CML)患者外周血单个核细胞 (PBMCs)为树突状细胞 (DCs) ,并对其形态、表型及对T细胞刺激增殖作用进行研究。方法　利用GM CSF、IL 4、TNF α体外定向诱导生成树突状细胞 ,对所诱生的细胞进行细胞表型及形态检测 ,用D FISH方法检测所诱生DCs的白血病源性 ,应用MTT法检测所诱生的DCs刺激T细胞增殖的能力。结果　CML患者PBMCs在体外可诱导生成bcr/abl融合基因阳性的DCs(CMLDCs)。CMLDCs对自体T细胞有明显刺激增殖作用 ,而CML细胞无此作用。CMLDCs刺激同一异体T细胞增殖能力弱于正常DCs,但当培养体系中加入 30 0U/ml干扰素 α(IFN α)时可使其刺激能力接近正常DCs。结论　CMLDCs具有刺激自体及异体T细胞增殖的能力 ,但对异体T细胞的刺激作用弱于正常DCs,IFN α可提高CMLDCs刺激T细胞增殖能力     

携带人6Ckine/IFNγ融合基因腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建携带人次级淋巴组织趋化因子(6Ckine)和γ-干扰素(IFNγ)融合基因的重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNγ,并在真核细胞中表达。方法RT-PCR法分别从人淋巴结和外周血单个核细胞中扩增人6Ckine cDNA和IFNγ cDNA,分两步先后将6Ckine cDNA和IFNγ cDNA连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,二者之间以XbaⅠ酶切位点相连,应用AdMax腺病毒包装系统在HEK293细胞内同源重组,构建重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNγ,经扩增和纯化后感染真核细胞HepG2,并检测6Ckine/IFNγ融合蛋白的表达。结果所构建的重组腺病毒Ad-6Ckine/IFNγ经扩增和纯化后,滴度为1.26×1010IFU/ml。PCR法鉴定无野生型腺病毒的污染,所携带的6Ckine/IFNγ融合基因能在真核细胞中得到表达,表达形式为分泌型。结论已成功构建重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNγ,并在真核细胞中表达,为进一步研究肿瘤的基因和免疫治疗奠定了基础。     

转基因树突状细胞激活细胞毒性T细胞特异性杀伤淋巴瘤的体外实验

目的 探讨转基因树突状细胞激活细胞毒性T细胞产生抗淋巴瘤的特异性细胞免疫反应。方法 采用人骨髓来源的髓系前体细胞,在人细胞因子IL-4、GM-CSF和INF-α诱导下,在体外生成大量树突状细胞。将制备好的含有IgVH1核酸质粒,用脂质体法转染树突状细胞。转染成功的树突状细胞与外周血T淋巴细胞共培养,激活特异性CTL细胞,与阳性表达IgVH1的人淋巴瘤Namalwa细胞反应,用3H-TdR掺入法观察CLLs对瘤细胞的特异性杀伤效应。结果 树突状细胞能够用脂质体方法转染IgVH1核酸质粒,并且有效递呈给外周血T细胞,对表达IgVH1的人淋巴瘤Namalwa细胞产生特异性免疫杀伤活性,与对照组相比差异有显著意义（P<0.01）。结论 体外诱导扩增的 DC能够转染 IgVH1核酸质粒,体外激活T淋巴细胞,产生特异性细胞毒效应。     

肿节风注射液对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖活力及NK细胞活性的影响

目的研究肿节风注射液(ZJF)对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖活力及NK细胞活性的影响,探讨其抗肿瘤作用的机制。方法无菌取C57BL/6纯系小鼠脾脏,制成5×106个/ml的单个脾细胞悬液,MTT法检测不同浓度(50、25、12.5、6.25和3.13 mg/ml,以生药量计)的ZJF对正常小鼠T淋巴细胞增殖的影响。将近交系615小鼠经左腋皮下注射小鼠前胃癌Fc细胞(1×106个/ml,0.2 ml/只),复制荷瘤小鼠模型,并随机分成5组:ZJF低、中、高剂量组(给药剂量分别为2、10、20 mg/kg,以生药量计)、CTX组[0.3 g/(kg·3 d)]及阴性对照组(生理盐水0.1 ml/10 g),MTT法检测ZJF对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖及NK细胞活性的影响。结果 ZJF可显著促进正常小鼠T淋巴细胞的增殖(P<0.05),且呈剂量依赖性;ZJF低、中、高剂量组荷瘤小鼠T淋巴细胞的增殖活力明显高于阴性对照组(P<0.05),且呈剂量依赖性,ZJF中、高剂量组荷瘤小鼠NK细胞的活性明显高于阴性对照组(P<0.05)。结论 ZJF可促进正常小鼠与荷瘤小鼠T淋巴细胞的增殖活力,增强NK细胞活性,为其抗肿瘤作用机制的研究提供了实验依据。     

嵌合抗原受体T细胞及T细胞抗原耦合器修饰T细胞技术的研究进展

目前,恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的公共问题之一。除手术、放疗、化疗、靶向疗法等方法外,随着分子生物学的发展,免疫疗法得到迅速发展,成为肿瘤治疗的一种新兴方法。临床免疫疗法采用最多的免疫细胞分别为DC、NK、CIK、CTL及嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)等。其中CAR-T技术全球研究最早,但由于其存在脱靶、神经毒性、转染载体缺陷等问题,在临床应用方面具有一定局限性。T细胞抗原耦合器修饰T细胞(T cell antigen coupler modified T cell,TAC-T)技术是在CAR-T技术基础上发展的一种利用天然T细胞受体(T cell receptor,TCR)修饰T细胞并重新靶向肿瘤细胞抗原的新技术。本文就CAR-T技术的研究现状及TAC-T技术的研究进展作一综述,以期为TAC-T技术作用机制及其临床应用安全性的深入研究提供参考。     

循环应用低剂量环磷酰胺对黑色素瘤荷瘤小鼠调节性T细胞的影响及抗瘤作用

目的观察循环应用低剂量环磷酰胺(CTX)对黑色素瘤荷瘤小鼠调节性T细胞(Treg)的影响及抗瘤作用。方法通过皮下接种黑色素瘤细胞B16制备黑色素瘤荷瘤小鼠模型;对荷瘤小鼠分别经腹腔单次或循环注射CTX,每隔7d给药1次,共3次,应用流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg的含量;培养小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC),将DC与脾T淋巴细胞混合培养,应用ELISA法检测脾T淋巴细胞干扰素γ(IFNγ)的分泌量;同时测量肿瘤的大小,绘制肿瘤生长曲线,并观察各组荷瘤小鼠自身免疫病的发生情况。结果CTX的最佳应用剂量为100mg/kg。随着荷瘤时间的延长,荷瘤小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+/CD4+的比值呈逐渐升高趋势。单次应用CTX抑制Treg的时间较短,而循环应用CTX能够延长对Treg的抑制,使其维持在相对较低的水平;循环应用CTX显著提高了荷瘤小鼠脾T淋巴细胞IFNγ的分泌水平。单次和循环应用CTX均未能延缓肿瘤的生长,两组小鼠均未见免疫性白斑及明显的化疗毒副反应。结论循环应用CTX能更加有效地调控Treg,从而促进DC对T淋巴细胞的抗原特异性激活,这将会提高DC疫苗的抗瘤效果。     

树突状细胞肿瘤疫苗的研究现状

本文综述了树突状肿瘤疫苗的研究及应用现状,其中主要包括树突状细胞的生物学特性、体外培养、肿瘤疫苗的制备、临床应用、存在的问题及展望等。     

树突状细胞疫苗的研究进展

树突状细胞（dendritic cell,DC）是一类强大的抗原提呈细胞,也是适应性免疫应答的关键步骤,对于诱导T、B细胞介导的细胞免疫和体液免疫是必需的。由于其特殊的免疫学功能,在DC疫苗的研究中备受关注。目前已有一种基于DC的疫苗Sipuleucel-T获批上市,还有多项DC疫苗正在临床试验阶段。本文对DC的生物学特征和功能、DC疫苗的类型以及DC疫苗面临的挑战和前景作一综述。     

组织定居T细胞的免疫学特征研究进展

传统观点认为:淋巴细胞通过淋巴组织和非淋巴组织的循环实现机体免疫调节和防御功能.近年来发现了一群长期定居于外周组织的淋巴细胞群,它们不参与血液循环,无需抗原提成、细胞激活就可以发生快速的免疫应答.本文根据现有研究对组织定居T细胞作一综述,并讨论其生物学特征和免疫功能.     

黄芪多糖对胃癌细胞上清液中培养的树突状细胞分化成熟及功能的影响

目的探讨黄芪多糖对胃癌细胞SCG-7901上清液中培养的树突状细胞(Dendritic cells,DC)分化成熟及功能的影响,分析黄芪多糖抗癌的作用机制。方法将人外周血分离的单核细胞加入含重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)和重组人白细胞介素的培养液中,随机分为空白组(以RPMI1640培养液培养)、干预组(以黄芪多糖干预后的胃癌细胞上清液培养)、对照组(以胃癌细胞上清液培养)。混合培养48h后,显微镜下观察DC成熟过程中的形态学变化,流式细胞术检测DC的表型(CD40、CD80),混合同种淋巴细胞增殖反应(Mixed lymphocyte reaction,MLR)检测DC的增殖效应。结果与对照组比较,空白组和干预组DC的CD40和CD80的表达均明显增加(P<0.05),刺激同种淋巴细胞增殖效应明显增强(P<0.05);干预组DC CD40和CD80的表达阳性率及刺激同种淋巴细胞增殖效应均明显低于空白组(P<0.05)。结论在体外,黄芪多糖可有效对抗胃癌细胞上清液引起的对DC分化成熟和功能的抑制。     

人乳头状瘤病毒16亚型E6E7基因重组腺病毒的构建及其在小鼠骨髓源树突状细胞中的表达

目的 构建人乳头状瘤病毒16亚型(Human papillomavirus 16,HPV16)E6E7基因重组腺病毒,并在小鼠骨髓源树突状细胞(Dendritic cell,DC)中表达。方法双酶切质粒pET-32a(+)-E6E7获得E6E7,基因片段,插入腺病毒穿梭质粒pAd-Track-CMV中,转染HEK293细胞,扩增病毒,经同源重组、包装后获得重组腺病毒pAd-E6E7,转染体外培养的小鼠骨髓源DC,激光共聚焦显微镜观察转染的小鼠DC的形态,流式细胞术检测转染前后小鼠DC表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C),Western blot检测E6蛋白的表达。结果双酶切及测序证实,重组腺病毒质粒pAd-E6E7构建正确,插入的E6E7基因片段序列正确;转染HEK293细胞48 h,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,重组腺病毒的滴度为3×107 CCID50/ml;重组腺病毒pAd-E6E7感染后DC的状态与成熟DC表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C)相符合,感染后的DC表面有许多树枝状、刺状突起,符合成熟DC的表面形态;感染后的DC中存在E6蛋白的表达。结论已成功构建了HPV16 E6E7基因重组腺病毒表达质粒,其能在小鼠骨髓源DC中表达。     

bFGF促增殖后骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞的分化

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)体外作用于骨髓间充质干细胞(Mesen-chymal stem cells,MSCs)后,诱导其向神经元样细胞和多巴胺能神经元样细胞定向分化的情况。方法从鼠骨髓中获得MSCs,培养传代,用MTT法检测bFGF对骨髓MSCs生长的影响。10 ng/ml bFGF作用2 d后,通过IBMX、细胞因子bFGF、GDNFI、L-1β、中脑神经胶质细胞条件培养基和中脑神经细胞膜碎片等分组联合诱导骨髓MSCs向神经元样细胞、多巴胺能神经元样细胞分化,免疫细胞化学方法鉴定特异标志NSE、MAP-2a,b和TH的表达。结果在一定范围内,bFGF对骨髓MSCs具有明显的促增殖作用。分化的神经元样细胞表达NSE、MAP-2a,b和TH,联合应用GDNFI、L-1β、中脑条件培养基和中脑神经细胞膜碎片诱导7 d后,NSE阳性率为(27.774±2.747)%,MAP-2a,b为(28.006±3.080)%,TH为(3.098±0.352)%。结论体外骨髓MSCs被诱导分化成神经元样细胞和多巴胺能神经元样细胞,为帕金森等中枢神经系统疾病的细胞移植治疗奠定了基础。     

T Lymphocyte Antigen 4-Modified Dendritic Cell Therapy for Asthmatic Mice Guided by the CCR7 Chemokine Receptor

The CD80/CD86-CD28 axis is a critical pathway for immuno-corrective therapy, and the cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA4) is a promising immunosuppressor targeting the CD80/CD86-CD28 axis; however, its use for asthma therapy needs further optimization. A human CTLA4 fused with the IgCγ Fc (CTLA4Ig) and mouse CC chemokine receptor type7 (CCR7) coding sequences were inserted into a recombinant adenovirus (rAdV) vector to generate rAdV-CTLA4Ig and rAdV-CCR7. The naive dendritic cells (DCs) were infected with these rAdVs to ensure CCR7 and CTLA4Ig expression. The therapeutic effects of modified DCs were evaluated. rAdV-CTLA4Ig and rAdV-CCR7 infected DCs improved all asthma symptoms. Inflammatory cell infiltration and cytokine analysis showed that rAdV-CTLA4Ig and rAdV-CCR7-modified DC therapy reduced the number of eosinophils and lymphocyte and neutrophil infiltration in the lung. Interestingly, assessment of the humoral immunity showed that the IL-4 and IFNγ levels of the rAdV-CTLA4Ig and rAdV-CCR7-modified DC-treated mice decreased significantly and did not reverse the Th1/Th2 balance. DCs expressing CCR7 displayed guidance ability for DC migration, primarily for DCs in the inflammatory lung. Additionally, the rAdVs caused an inflammatory response by inducing DC differentiation, inflammatory cell infiltration and changes in cytokines; however, mice transplanted with rAdV-green fluorescent protein (GFP)-infected DCs displayed no asthma manifestations. In conclusion, CTLA4Ig-modified DCs exhibited a therapeutic effect on asthma, and CCR7 may guide DC homing. The combination of these two molecules may be a model for precision-guided immunotherapy.     

川芎嗪对肝星状细胞增殖及结缔组织生长因子表达的影响

目的探讨川芎嗪(TMP)对肝星状细胞HSC-T6增殖及结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法不同剂量的TMP作用于HSC-T6细胞不同时间后,MTT法检测细胞的增殖;ELISA法检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原和透明质酸(HA)的合成;West-ern blot法测定CTGF的表达。结果100～1000mg/L的TMP作用于HSC-T6细胞后,细胞的增殖明显受到抑制,且呈剂量依赖性;Ⅰ型、Ⅲ型胶原和HA的合成减少,CTGF的表达也减少,二者下降程度呈正相关(r分别为0.727、0.643和0.769)。结论TMP能够有效抑制肝纤维化形成,其可能的机制为抑制HSC增殖并降低CTGF的表达,从而阻断细胞内基质的形成。     

干细胞分化为胰岛细胞的研究进展

糖尿病是以高血糖为代谢特征的严重影响人类健康的疾病。目前,糖尿病较理想的治疗方法是胰腺移植,但受供体缺乏和免疫排斥两方面的限制而不能普遍应用。干细胞由于具有自我更新和多分化潜能,其作为糖尿病细胞替代治疗的种子资源,已成为目前研究的热点。本文对近年来干细胞分化为胰岛细胞的研究进展作一综述。     

Review of Dendritic Cells,Their Role in Clinical Immunology,and Distribution in Various Animal Species

Dendritic cells (DCs) are cells derived from the hematopoietic stem cells (HSCs) of the bone marrow and form a widely distributed cellular system throughout the body. They are the most efficient, potent, and professional antigen-presenting cells (APCs) of the immune system, inducing and dispersing a primary immune response by the activation of naïve T-cells, and playing an important role in the induction and maintenance of immune tolerance under homeostatic conditions. Thus, this review has elucidated the general aspects of DCs as well as the current dynamic perspectives and distribution of DCs in humans and in various species of animals that includes mouse, rat, birds, dog, cat, horse, cattle, sheep, pig, and non-human primates. Besides the role that DCs play in immune response, they also play a pathogenic role in many diseases, thus becoming a target in disease prevention and treatment. In addition, its roles in clinical immunology have also been addressed, which include its involvement in transplantation, autoimmune disease, viral infections, cancer, and as a vaccine target. Therefore, based on the current knowledge and understanding of the important roles they play, DCs can be used in the future as a powerful tool for manipulating the immune system.