嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶在毕赤酵母中的分泌表达

以嗜酸乳杆菌AS1.1854来源的亚油酸异构酶基因为模板,用PCR方法扩增目的片段,并克隆到pMD19T载体.经双限制性酶切的pMD19T-LAI和载体pPICZαA连接转化得到重组质粒pPICZαA-LAI.将阳性重组质粒用sac Ⅰ进行线性化后,经化学法转化毕赤酵母GS115.提取重组酵母GS 115/pPICZαA - LAI基因组,利用交叉引物通过PCR方法筛选重组子.阳性毕赤酵母GS115/pPlCZαA-LAI经1％甲醇诱导,分泌表达出相对分子质量为69 000亚油酸异构酶.经测定发酵上清酶活力为0.107 U,未破碎重组酵母酶活力0.08 U.     

亚油酸异构酶分子生物学研究进展

对亚油酸异构酶基因克隆、序列分析及基因的外源表达等研究现状进行了综述,并对已经克隆到的酶蛋白序列进行了初步的分析与比对,探讨了其序列与功能之间的相互关系,对亚油酸异构酶的进一步研究进行了展望.     

微生物共轭亚油酸异构酶的生物学研究

在各种共轭亚油酸异构体中,c9,t11-18∶2和t10,c12-18∶2这两种天然不饱和脂肪酸异构体被认为具有生物活性,如抗癌、抗动脉粥样硬化、减肥、促进生长、缓和免疫反应副作用等,因而在医药、食品、保健品、化妆品等领域有着广阔的应用前景.一些微生物能产生共轭亚油酸异构酶(Conjugated linoleic acid isomerase,EC 5.2.1.5),该酶又能专一性地催化亚油酸转化为活性共轭亚油酸异构体的反应,因此近几年来倍受关注,利用生物合成法生产共轭亚油酸已成为该领域未来的发展趋势.然而目前,共轭亚油酸异构酶的物种分布及进化关系、在细胞中的生物学功能、结构域、催化反应机理等尚未得到完整的阐释,利用基因工程技术大量高效地表达有活性的重组酶也尚未得到很好的解决.本文在前人对共轭亚油酸异构酶进行的多方面研究的基础上,对近年来共轭亚油酸异构酶的分布、生物学作用、酶的催化反应机理、酶基因的克隆表达等生物学方面的研究进展进行了综述,并利用生物信息学方法对已知的共轭亚油酸异构酶序列进行了初步分析.     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶的结构与催化机理

对嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因及其启动子进行了定位,采用多种软件分析了酶蛋白中α螺旋、β折叠等二级结构的组成以及酶蛋白中的糖基化位点、磷酸化位点的分布.证明了该蛋白具有肌凝蛋白交叉反应抗原、链状球菌的67 000肌凝蛋白交叉反应抗原、番茄红素脱氢酶相关蛋白和FAD结合蛋白等4个功能结构域,并首次提出其催化共轭亚油酸合成时可能存在氧化还原反应过程.     

培养条件对一株嗜酸乳杆菌突变株亚油酸异构酶活力的影响

对一株嗜酸乳杆菌突变株产亚油酸异构酶的条件进行了研究,得到最佳产酶条件为:以脱脂乳作为培养基,添加3%的乳糖、1%的(NH4)2SO4、0 1%的亚油酸及1%的NaCl,接种量为1%,培养时间为36h.在此条件下,所合成的亚油酸异构酶活力达252 0U/mL.     

嗜酸乳杆菌表面疏水性对其亚油酸异构酶酶活的影响

研究碳源、氮源、生长时间以及生长温度对嗜酸乳杆菌细胞表面疏水性及其亚油酸异构酶酶活力的影响.通过Minitab15软件进行嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶酶活力对其表面疏水性的回归分析,结果表明,嗜酸乳杆菌菌体表面疏水性与其亚油酸异构酶酶活成正相关关系,回归方程为:y=1.5500x+78.163.R2=0.7507说明模型有较高的拟合度,显著性分析P(0.003)P(0.05),结果显著,可作为响应预测.     

罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶的生物信息学分析

综合利用多种生物信息学工具对罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶基因及其启动子区进行了定位,分析了4种乳酸菌亚油酸异构酶基因的上游调控区,发现了主要保守位点.分析证明罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶具有2个二硫键,1个糖基化位点,多个磷酸化位点,无信号肽序列,但在25(26)~42位存在跨膜区.证明罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶的密码子偏好性与大肠杆菌和酿酒酵母的密码子偏好性存在差异,初步分析了该基因在这些宿主菌中表达时可能存在的问题,并提出了改造方案.     

培养条件对一株嗜酸乳杆菌突变株亚油酸异构酶活力的影响

对一株嗜酸乳杆菌突变株产亚油酸异构酶的条件进行了研究，得到最佳产酶条件为：以脱脂乳作为培养基，添加3％的乳糖、1％的(NH4)2SO4、0．1％的亚油酸及1％的NaCl，接种量为1％，培养时间为36h，在此条件下，所合成的亚油酸异构酶活力达252．0U／mL。     

醛糖还原酶cDNA的克隆和表达

醛糖还原酶能促使葡萄糖转化成山梨醇,是多元醇代谢通路的限速酶,与糖尿病并发症的发生和发展有密切关系.用RT-PCR扩增醛糖还原酶基因,将扩增产物克隆到大肠杆菌表达载体pET22b(+),构建重组表达载体pET22b(+)-AR.经PCR、双酶切和序列测定鉴定后,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定后,利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化获得重组蛋白AR-(His)6.紫外分光光度法对AR-(His)6进行酶活检测,其比活力为0.45 U/mg,为下一步筛选具有抑制醛糖还原酶活性的化合物及开发有临床应用价值的醛糖还原酶抑制剂提供参考.     

携带Herceptin与MICA胞外结构域融合基因的重组腺病毒的构建及鉴定

通过构建能表达抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为进一步联合NK细胞的治疗研究奠定基础.采用Overlap-PCR的方法获得Herceptin与MICA胞外结构域的融合基因,并将融合基因连接到载体pDC339上.接着再利用酶切及PCR方法鉴定载体及重组病毒基因的正确性,并通过ELISA和Westem Blot检测融合蛋白的表达情况,最后经间接免疫荧光分析(IFA)检测融合蛋白的结合特性.构建的载体酶切后经电泳鉴定证实构建成功,重组病毒DNA的PCR显示病毒携带了Herceptin的轻链基因、重链基因及MICA胞外结构域的基因;ELISA和Western Blot证实重组腺病毒成功地表达出了目的融合蛋白;IFA实验表明融合蛋白能与SK-OV-3细胞表面的Her-2受体特异性地结合.最后成功地构建了能表达具有正常结合特性的抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为之后与NK细胞的联合治疗研究奠定基础.     

微生物亚油酸异构酶的生物信息学分析

运用生物信息学方法,对已在GenBank上公开发表的罗伊氏乳杆菌、疮疱丙酸杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和短双岐杆菌等的亚油酸异构酶基因序列进行了分析,并对这些基因序列编码的蛋白质进行了预测.     

产共轭亚油酸乳酸菌的选育和鉴定

采用紫外分光光度法测定共轭亚油酸的含量,从13株实验室保存的乳酸菌中筛选出8株具有转化亚油酸生成共轭亚油酸能力的菌株.其中As1.2686产量最高,发酵液中共轭亚油酸含量达到13.63 mg/L;其次是菌株B11693,共轭亚油酸产量为11.55 mg/L.选择B11693做进一步的菌种鉴定,将传统的形态学、生理生化鉴定方法和细菌16SrDNA分子生物学鉴定方法相结合,鉴定菌株B11693为短乳杆菌.     

嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶基因的克隆与序列分析

将GenBank中已报道的罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶基因对已公布的嗜酸乳杆菌NCFM基因组全序列做tblast,找到一个同源编码框.参照此编码框的核苷酸序列及pQE30质粒图谱特性设计上、下游引物,利用PCR法扩增嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶基因,并克隆到pQE30质粒载体上进行测序.分析测序结果表明,扩增得到的目的DNA全长1 776 bp,G C含量为37.5%,共编码591个氨基酸,理论相对分子质量67.5kDa.用Signal P3.0对其N端前70个氨基酸序列进行分析,结果表明,第20~40位氨基酸有较强的疏水性.不过,N端前70个氨基酸的C值、S值和Y值并不高,最有可能的酶切位点位于第45位与第46位氨基酸之间,但预测其被切割的可能性概率低于1%.可以推断,在嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶的N端氨基酸序列中不存在信号肽序列.     

结核分枝杆菌融合抗原Ag85B-ESAT6真核表达载体的构建及鉴定

以结核分枝杆菌H37Rv株的基因组作为模板,将Ag85B和ESAT6编码基因进行PCR扩增,然后采用基因剪接重叠扩增PCR法(gene SOEing)将其通过疏水甘氨酸接头(GGIGIAPG)连接融合,定向克隆至质粒Pvax1中,构建结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合抗原的真核表达质粒Pvax1/AE.经单双限制性内切酶图谱、PCR产物及DNA测序分析等多种方法鉴定,证实Pvax1/AE真核表达质粒构建成功.为进一步研究其结核核酸疫苗原型的免疫保护效果奠定了基础.     

过量表达苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌合成L–异亮氨酸的影响

考察过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌发酵生产L-异亮氨酸的影响.将解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶基因ilvA（F383V）连接大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19,过量表达于L-异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum YILW.经5 L发酵罐分批补料发酵产酸实验,与出发菌株C.glutamicum YILW相比,耗糖高峰期滞后,L-异亮氨酸产量增加了10.3%,副产物L-蛋氨酸、L-赖氨酸含量分别降低了33.3%2、6.5%,发酵液中没有L-苏氨酸的累积,乳酸的累积量增加了41.7%.对发酵稳定期的代谢流分布研究表明,过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶使HMP途径流量增加了31.7%,L-异亮氨酸生物合成途径的代谢流提高了8.5%.     

人瘦素基因在毕赤酵母中的分泌表达

将人瘦素成熟蛋白编码序列同义突变成毕赤酵母偏好密码子,人工合成全基因序列。将基因直接连接到pPIC9载体信号肽识别序列之后,构建毕赤酵母真核表达载体pPIC9-hLeptin,电转化毕赤酵母菌株GS115,用PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达目的蛋白的酵母工程菌。结果表明,成功构建了重组人瘦素毕赤酵母工程菌株,能稳定、高效分泌表达重组人瘦素蛋白,表达量高峰出现在诱导96h后,摇瓶表达量为200mg.L-1。     

基于cdd基因敲除和嘧啶操纵子转移的胞苷产生菌的研究

以大肠杆菌作为出发菌株,通过基因工程手段对其进行改造,旨在提高胞苷产量.首先,通过Red重组系统敲除了大肠杆菌MG3028基因组上的胞苷脱氨酶基因（cdd）,阻断了胞苷的分解代谢.然后,构建了含解淀粉芽孢杆菌TS8嘧啶操纵子结构基因的重组质粒pPYR3021,并将其转入E.coli MG3028（△cdd）.与出发菌株E.coli MG3028相比,E.coli MG3028（△cdd）的胞苷产量提高了近2倍,而尿苷产量降低了近75%,携带重组质粒pPYR3021的菌株胞苷产量较出发菌株提高了近6倍.     

花椒籽皮油和仁油化学成分分析

对分别提取的花椒籽皮油和仁油进行理化指标分析 ,发现仁油中酸值和过氧化值均低于其皮油中的酸值和过氧化值 .对皮油和仁油总脂肪酸测定表明 :皮油主要含棕榈酸、棕榈油酸、油酸和亚油酸 ,其中在其它植物油中含量很少的棕榈油酸 ,在花椒籽皮油中含量约 2 0 % .仁油中不饱和酸含量高达 90 %以上 ,其中人体必需的亚油酸和亚麻酸含量在 70 %以上 .     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性检测

将PCR扩增的人溶菌酶编码基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,双酶切和测序鉴定表明,重组载体构建正确。电转化毕赤酵母GS115菌株,通过G418筛选获得高拷贝重组菌株后,用甲醇诱导表达;通过SDS-PAGE检测证明上清中有目的蛋白,表达产物与预期大小的人溶菌酶蛋白分子质量15ku一致,其表达量占分泌总蛋白的32%。体外抑菌实验证实重组人溶菌酶蛋白对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌均有明显的抑菌作用,表明在毕赤酵母中成功表达了重组人溶菌酶。