广东客家娘酒发酵过程中产β-葡萄糖苷酶酵母菌的筛选及酶学性质研究

采用七叶苷分离培养基初筛、4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPGal）显色法复筛的方法从广东客家娘酒发酵过程中的酒糟中筛选产β-葡萄糖苷酶能力较强的酵母菌,通过26S rDNA D1/D2区基因序列分析对其进行鉴定,并对其酶学性质进行分析。结果表明,获得1株产β-葡萄糖苷酶能力较强的假丝酵母Candida apicola kj_312。该菌株所产的β-葡萄糖苷酶具有较宽的底物特异性,最适底物为对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷;最适反应温度为60 ℃,在25～65 ℃范围内,相对酶活力＞50%;最适pH值为4.5,在pH值为4.0～7.0酸性范围内,相对酶活力＞80%;1 mmol/L的Ca2+、Mn2+、Zn2+和Fe2+及100 mmol/L的Ca2+、Zn2+和Fe2+能显著提高酶活力。     

Leifsonia菌β-葡萄糖苷酶（Lf18920）的酶学性质研究及对藏红花素转化作用的初步研究

克隆表达了一种赖氏菌（leifsonia spp. ZF2019）的一个GH3家族糖苷酶基因（Lf18920），以pET-28a-HMT为载体构建了表达质粒，在大肠杆菌BL21中诱导表达，用Ni-NTA柱纯化表达蛋白。研究了该酶的底物特异性及动力学参数，分析了温度、pH、金属离子等因素对该酶活性的影响，并采用高效液相色谱和液质联用色谱探究了该酶对藏红花素的转化作用。结果表明：该酶与4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl beta-D-glucopyranoside,pNPG）的亲和力最强，对底物pNPG的特征常数Vmax和Km分别为0.155U/mg和1.97 mmol/L。该β-糖苷酶的最适温度为40℃，最适pH为5.0；低浓度的Zn2+使酶活提高了37%左右，SDS和吡啶可以使酶完全失活，可耐受1%的尿素（仍能保持77%的相对酶活）。该酶能部分水解藏红花素，但不能将其彻底水解成藏红花酸。研究结果表明，该酶可用于以藏红花素为底物的不同水解度藏红花苷的制备。     

使用分离自啤酒废水的木霉菌TP09固态发酵提纯β-葡聚糖酶

使用木霉TP09固态发酵,提纯并鉴定了β-1,3-葡聚糖酶的部分性质。采用饱和度为70%的（NH4）2SO4及DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B柱层析纯化,β-葡聚糖酶相对粗酶溶液纯化了28.7倍,酶回收率为45.2%。经SDS-PAGE分析,该酶分子量近似54.6KD。酶最适反应pH为5.0,最适温度为50℃。在pH3.0～5.0、温度30～70℃酶活相对稳定。Fe^3＋、Mg^2＋、Mn^2＋以及Cu^2＋对该酶有抑制作用,Zn^2＋、Ca^2＋和Fe^2＋则有激活作用。底物选择性研究表明该酶为β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶。该酶可作用于含β-1,3、β-1,4糖苷键的底物,对含α-1,4和α-1,6糖苷键的底物无作用。表明分离自啤酒废水的木霉TP09生产的β-1,3-葡聚糖酶可增强不溶性β-1,3-葡聚糖的可溶性,促进了其在免疫疗法中的应用。     

海藻糖合成酶产生菌SL301发酵条件研究

该实验选用SL301菌株产生的海藻糖合成酶,以麦芽糖为底物转化生产海藻糖。实验表明,该菌株发酵的最适碳、氮源分别为甘油和酵母膏,最适发酵温度为37℃,pH为7.0,装液量为150ml／750ml。     

应用RT-PCR技术定量检测发酵乳中Lactobacillus plantarum活菌数

根据发酵乳中常见乳酸菌种的16S rRNA基因序列设计了L.plantarum的种属特异性引物,应用该引物对植物乳杆菌的模式菌株L.plantarum ATCC14917、L.plantarum非同源性对照菌株及采自西藏地区的自然发酵乳样品进行了种属特异性PCR检测,并以样品RNA转录的cDNA为模板,对检出含有L.plantarum的发酵乳样品进行了Real-Time PCR定量检测。通过Real-Time PCR图谱分析,准确地检测出了该样品中L.plantarum活菌数的含量为6.6lgcfu/mL。结果表明该方法能够简便、快速地检测出发酵乳中是否含有L.plantarum,并能够对其活菌数进行准确地定量,对发酵乳的生产和监管提供了重要的理论和实践依据。     

酿酒酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的酶学性质研究

本文对酿酒酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)的-般酶争I生质进行研究,得出如下结论:酵母表面展示CALB在碱性条件下具有很好的稳定性和水解活性.其水解对硝基苯酚酯的最适反应pH值范围是8.0～8.5,与游离的CALB商品酶相比,向碱性条件偏移.最适反应温度范围是40～45℃.最适反应底物为对硝基苯酚丁酸酯,表现出极为明显的底物特异性.Ca2 、Mg2 对其有明显的激活作用.K 对其有微弱的激活作用.而Co2 、Cu2 对其有明显的抑制作用.本研究为酵母表面展示脂肪酶的应用研究奠定理论基础.     

黄杆菌褐藻胶裂解酶的高效表达及其在褐藻寡糖制备中的应用

研究黄杆菌褐藻胶裂解酶基因（rFlAlyA）在枯草芽孢杆菌中的高效表达,高密度发酵48 h最高酶活力为2 550 U/mL,蛋白质量浓度达4.5 mg/mL。经(NH4)2SO4沉淀和SP强阳离子交换柱纯化后得到电泳级纯酶,分子质量约为30 kDa。褐藻胶裂解酶rFlAlyA最适pH值为7.5,在pH 4.0～11.0范围内可保持80%以上酶活力;最适温度为50 ℃,在50 ℃及以下可保持80%以上酶活力。底物特异性分析表明,rFlAlyA特异性降解聚甘露糖醛酸片段,最短链底物为甘露糖醛酸三糖。rFlAlyA在最适条件下酶解褐藻酸钠4 h后还原糖质量浓度达33 mg/mL,底物转化率为70.1%,电喷雾电离-质谱分析酶解产物的聚合度（degree of polymerization,DP）为1～8,离子色谱分析显示DP=3时相对含量最高,为34.0%。结果表明,经枯草芽孢杆菌高效表达的rFlAlyA可用于制备褐藻寡糖。     

清香型白酒酒醅中乳酸高产菌株的筛选及乳酸的分离纯化

该研究以分离自清香型白酒酒醅的10株乳酸菌为研究对象，采用溶钙圈法和液体发酵法从中筛选高产乳酸菌株，并对其产乳酸条件进行考察；然后通过活性炭和离子交换柱对乳酸进行分离纯化，并通过高效液相色谱（HPLC）法检测乳酸纯度。结果表明，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SL32-2为高产乳酸的菌株，其在高粱糖化液中产乳酸的最佳发酵温度和初始pH值分别为35 ℃和7.0。活性炭对其发酵液的最适处理条件为活性炭添加量1.5 g/100 mL、处理温度60 ℃、处理时间2 h，此时脱色率、脱糖率和脱蛋白率分别为72.65%、3.75%和85.81%。经离子交换柱进一步纯化后，乳酸总得率为51.12%，其中阴离子交换柱的洗脱液中乳酸纯度较高。     

使用分离自啤酒废水的木霉菌TP09固态发酵提纯β-葡聚糖酶

使用木霉TP09固态发酵,提纯并鉴定了β-1,3-葡聚糖酶的部分性质。采用饱和度为70％的（NH4）2S04及DEAE--琼脂糖凝胶CL-6B柱层析纯化,β-葡聚糖酶相对粗酶溶液纯化了28．7倍,酶回收率为45．2％。经SDS--PAGE分析,该酶分子量近似54．6KD。酶最适反应pH为5．0,最适温度为50℃。在pH3．0-5．0、温度30℃-70℃之间酶活相对稳定。Fe3＋、Mg2＋、Mn2＋以及Cu2＋对该酶有抑制作用,Zn2＋、Ca2和Fe2＋则有激活作用。底物选择性研究表明该酶为β-1,3、β-1,4-葡聚糖酶。该酶可作用于含β-1,3、β-1,4糖苷键的底物,对含α-1,4和α-1,6糖苷键的底物无作用。以上表明分离自啤酒废水的木霉TP09生产的β-1,3-葡聚糖酶可增强不溶性β-1,3-葡聚糖的可溶性,促进了其在免疫疗法中的应用。     

米曲霉菌今野菌株所产蛋白酶性质的研究

采用(m)2SO4盐析,再透析提纯得到今野菌株的蛋白酶,该酶热稳定性好,40℃保温5小时,剩余酶活为54%,采用正交试验,得其在反应过程中所受因素影响大小为pH＞酶液浓度＞底物浓度＞温度.酶反应的最适pH为7.0,最适温度为40℃.在以酪素为底物时,该蛋白酶的Km值为6.6‰,NaCl对其有抑制作用.抑制类型为非竞争性抑制.     

黑曲霉羧肽酶CapA的克隆表达与酶学性质解析

通过对A.niger CBS 513.88基因组信息进行阅读和比对分析,发现一个新的丝氨酸羧肽酶基因CapA,并在毕赤酵母中进行克隆表达。在摇瓶发酵水平,重组菌GS115（pPIC9K-CapA）的羧肽酶酶活达到109.7 U/mL。酶学性质研究表明该酶最适温度和pH值分别为45℃和6.0;在30℃～50℃或pH 4.0～8.0孵育1 h,仍可保持80%或60%以上的活力;Mg2+可以显著提高酶活,Cu2+、Fe2+、Co2+和苯甲基磺酰氟则对酶活有明显的抑制作用。在6种被检测的底物中,CapA可以水解其中的5种,具有较广泛的底物特异性,并且偏好水解羧基端疏水性氨基酸亮氨酸和赖氨酸,苄氧羰基-苯丙氨酰-亮氨酸是其最适底物。CapA较好的耐热性和pH值稳定性以及水解底物特征表明其在食品和生物技术领域有较好的应用基础。     

南酸枣中多酚氧化酶的特性研究

以南酸枣为原料,利用磷酸盐溶液提取其多酚氧化酶(PPO)粗酶液。以邻苯二酚为底物,采用分光光度法测定南酸枣PPO的活性。研究温度、pH对南酸枣PPO活性的影响以及底物特异性,并探讨抗坏血酸、亚硫酸钠、L-半胱氨酸、柠檬酸、酒石酸和氯化钙6种抑制剂对南酸枣PPO的抑制效果。结果表明:南酸枣PPO最适反应温度为50℃;最适pH值为7.0;邻苯二酚、对叔丁基邻苯二酚及4-甲基儿茶酚作为底物时PPO的活性较高,没食子酸及焦性没食子酸性作为底物时PPO的活性较小;6种抑制剂对南酸枣PPO均表现出一定的抑制作用,其抑制效果为:抗坏血酸亚硫酸钠L-半胱氨酸柠檬酸酒石酸氯化钙。     

鲈鱼脯氨酰内肽酶的分离纯化、性质分析及分子克隆

采用(NH4)2SO4盐析和连续柱层析法从鲈鱼（Lateolabrax japonicus）骨骼肌中分离纯化了一种脯氨酰内肽酶（prolyl endopeptidase,PEP）。通过液相色谱-串联质谱分析,得到43 个与红鳍东方鲀的PEP高度一致的肽片段,证实该酶为PEP。以琥珀酰-甘氨酰-脯氨酸-4-甲基-7-香豆素为底物,确定PEP的最适pH 6.0和最适温度35 ℃。温度变化对PEP活力的影响较大,通过圆二色谱检测显示加热对PEP的二级结构有较为明显的影响,且热变性不可逆。通过分子克隆技术获得PEP全长cDNA开放阅读框含2 226 个核苷酸,编码741 个氨基酸残基,预测分子质量为84.12 kDa。通过同源建模得到鲈鱼PEP的分子结构,PEP为典型的α/β水解酶折叠排列,其催化三联体（His-711、Asp-672、Ser-585）被β-折叠形成的螺旋桨区域的中心通道所覆盖。催化活性中心空间构象稳定对维持PEP活力至关重要,而其独特的分子结构是底物特异性的基础。     

透性化细胞海藻糖合酶特性的研究

海藻糖是一种新型食品添加剂，目前多以微生物酶法生产。海藻糖合酶是近年来新发现的一种海藻糖合成酶。本文研究了经渗透细胞技术处理得到的透性化细胞海藻糖合酶的酶学特性。结果表明，该细胞酶的反应最适温度为35℃，最适pH7.4,Mg^2 及K^ 对该细胞酶有明显激活作用，Zn^2 ,Mn^2 及Cu^2 则可强烈地抑制酶活力。该酶对底物特异性极强，能特异性地将麦芽糖转化为海藻糖。     

乳酸菌β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性研究

本文采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-52离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤方法分离纯化乳酸菌中β-葡萄糖苷酶.经SDS-PAGE测定其相对分子量约为60kD.该酶以对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷为底物时,最适pH值和最适温度分别为6.0和40℃.在45℃以下,pH值在4.5～7.0之间酶活力相对稳定.Hg^2＋和Ag^＋对该酶活力有明显的抑制作用.     

马铃薯中多酚氧化酶酶学特性的研究

以马铃薯为供试原料提取多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO),以邻苯二酚为底物,采用分光光度法确定其最佳波长为420 nm;研究温度、pH值、底物浓度和加热时间对该酶活性的影响,探讨了抗坏血酸、柠檬酸、氯化钙、EDTA-Na 4种抑制剂对马铃薯酶促褐变的抑制效果.结果表明:该酶的最适温度30℃,最适pH值为5.5,最适底物浓度0.05mol/L,90℃加热处理80 s时,该酶已基本失活.4种抑制剂对该酶均表现出一定的抑制效果,其中抗坏血酸的抑制效果最好,抑制效果强弱次序为抗坏血酸＞氯化钙＞柠檬酸＞EDTA-Na.     

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶的分离纯化及其酶学特性

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶经强阴离子柱、高效制备液相色谱和多肽分子筛纯化得到液相级纯酶(95.6%)。该酶比活力为125 U/g,纯化倍数为446,回收率为2.39%。纯化后的类胡萝卜素裂解酶经液相色谱-质谱联用测定,得其分子质量为655.093 D。关于酶学特性,研究发现该酶对C_(40)类胡萝卜素底物的最适温度为60℃,而作用于β-阿朴-8’-胡萝卜醛的最适温度是50℃,该酶的稳定温度为50℃以下;该酶对所测定底物的最适p H值为3.0;该酶与5种底物亲和力排列为:玉米黄质虾青素β-胡萝卜素角黄质β-阿朴-8’-胡萝卜醛;Al~(3+)和Fe~(3+)是该酶的强效催化剂,Fe~(2+)是该酶的强效抑制剂;H_2O_2在低浓度范围内(0~16 mmol/L)可促进酶活性;低体积分数乙醇(4%~16%)的添加对酶活性无明显抑制作用。结果表明该酶具有很好的耐酸性和热稳定性,能够适应果酒环境,为其工业化应用提供依据。     

一株高产苯乳酸菌株的安全性评价与发酵工艺优化

该研究利用传统生物发酵技术生产苯乳酸,并对高产苯乳酸菌株种属、安全性以及发酵工艺进行研究。通过反相高效液相色谱法筛选得到1株高产苯乳酸菌株BLCC2-0069,该菌株发酵24 h后发酵液中苯乳酸的含量为1.26 g/L;借助菌株形态观察和16S r DNA序列鉴定,初步确定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillu plantarum);该菌株培养4 h进入对数生长期,10 h进入稳定期,活菌数可达到1.78×109 cfu/mL。通过对该菌株的小鼠体内安全评价,初步确定该菌株的体内安全性。同时还对植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0069的发酵工艺进行研究,发现在培养基中添加3.00 g/L苯丙酮酸为底物时发酵液中苯乳酸产量最高可达3.96 g/L。综上,植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0069对小鼠无毒,具有较高生物安全性,直接发酵苯乳酸的产量可达到1.26 g/L,添加底物发酵苯乳酸产量可达到3.96 g/L。研究结果可为菌株的安全应用提供理论基础。     

南极磷虾自溶酶性质的初步研究

探讨南极磷虾自溶酶的最适pH值、最适温度以及抑制剂和金属离子对其活性的影响。结果表明:南极磷虾自溶酶主要含有3种酶,最适pH值分别为3.0、6.0、8.0;各最适pH值条件下最适温度分别为40、50、50～60℃之间。苯甲基磺酰氟(PMSF)和大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)对南极磷虾自溶酶活性有较强的抑制作用,抑制范围分别在pH3.0～9.0之间和pH6.0～10.5之间。Cu2+和Ba2+对自溶酶活性的抑制作用较强,Ca2+对自溶酶活性几乎没有抑制作用,而Mg2+对自溶酶活性有一定的激活作用。     

胆固醇氧化酶的发酵条件及酶学性质研究

Brevibacterium sp．可以发酵生产胆固醇氧化酶,实验中对该菌种进行了底物诱导及发酵条件的优化, 确定其最适培养基为(%)：蔗糖0．3,酵母膏0．2,蛋白胨0．3,牛内膏0．3,K_2PO_4 0．1,MgSO_4 0．05,pH6．8。最适培养条件为：接种量5%,24℃培养20h,通气量为50mL 培养基/250mL 三角瓶,200r/min。在最适培养基及最适条件下,胆固醇氧化酶的酶活力可达到24．01U/mg,比未优化前1．71U/mg 提高了14倍。该酶具有较强的酸碱稳定性和热稳定性,最适 pH 为6．5,最适温度为54℃。在最适 pH 和温度条件下测得该酶 km 值为7．1 ×10~(-5)mol/L。