甜菜M14品系BvM14-SAMS2基因的克隆及表达特异性分析

甜菜M14品系富含丰富的优质基因资源,对盐、寒冷、干旱等非生物胁迫具有极强的耐受性,是研究逆境胁迫极为难得的材料。课题组前期以甜菜M14品系为试验材料,在500mmol/L NaCl胁迫下,从蛋白质水平筛选获得了76个差异蛋白质点,在转录水平筛选获得了58个Unigenes序列,二者匹配得到了蛋白质点——BvM14-SAMS2。试验采用RACE技术,克隆获得甜菜M14品系BvM14-SAMS2基因cDNA全长1 538bp,包含最大开放阅读框ORF 1 182bp,编码393个氨基酸。采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术对甜菜M14品系BvM14-SAMS2基因的表达特异性进行分析,结果表明,在正常生长条件下,BvM14-SAMS2基因在甜菜M14品系根、茎、叶、花中的表达量大小依次为:根>叶>花>茎。受盐胁迫诱导,BvM14-SAMS2基因在甜菜M14品系叶片中的表达量随着盐浓度的增大而增大,根中的表达量随着盐浓度的增大无明显变化。研究结果表明,BvM14-SAMS2基因在甜菜M14品系叶片中受盐胁迫诱导表达,该基因在胁迫下的表达量增加可能有利于植物抵御盐胁迫损伤。     

盐胁迫下甜菜M14品系BvM14-ATPaseF、BvM14-ATPaseH、BvM14-PsaD基因的表达分析

甜菜M14品系是由栽培甜菜和野生白花甜菜杂交后获得的带有野生白花甜菜第9号染色体的单体附加系,具有抗逆、无融合等优良特性。在前期工作中,对盐胁迫下叶片膜蛋白进行了定量蛋白质组学分析,与未处理对照相比,200、400mM盐胁迫下共获得50个差异蛋白质点,选择其中3个蛋白质点为研究对象,与实验室前期相同盐处理下获得的转录组数据库相匹配,获得基因cDNA全长,将此3个基因命名为BvM14-ATPaseF、BvM14-ATPaseH和BvM14-PsaD;进行在线功能预测;设计引物,对盐胁迫(0、200、400 mM)处理下此3个基因进行实时荧光定量分析,了解在盐胁迫下基因转录与蛋白水平上表达量的关系。结果表明,与未处理对照相比,200、400 mM盐浓度处理下BvM14-ATPaseF基因分别上调3.70与4.47倍,BvM14-ATPaseH基因在盐胁迫处理下分别上调0.85与1.36倍,而BvM14-PsaD基因随着盐浓度的增加却下调0.97与2.54倍,表明在盐胁迫下不同基因具有的功能不同,而导致转录水平与蛋白水平的表达量并不完全相同。     

甜菜M14品系BvM14-APX、BvM14-DHAR3、BvM14-MDAR基因响应NaCl胁迫的表达分析

甜菜M14品系是在二倍体栽培甜菜染色体组上附加野生白花甜菜第9号染色体的单体附加系,具有耐盐性、无融合生殖等优良性状,是发掘优质基因资源的良好研究材料。实验室前期已利用i TRAQ串联LC-MS/MS技术获得0、200、400 m M Na Cl胁迫下叶中差异表达蛋白质76个;与利用Hiseq 2000高通量测序技术构建的Na Cl(0、200、400 m M)胁迫下甜菜M14品系转录组数据库相匹配,得到了3条参与抗氧化酶系统的Bv M14-APX、Bv M14-DHAR3及Bv M14-MDAR的Unigenes序列。对3条Unigenes序列进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术对0、200、400 m M Na Cl胁迫下叶和根中的3条基因进行组织特异性分析,探究3条基因在叶和根中的表达趋势,并比较了叶中3条基因在转录水平和蛋白水平的表达量变化是否一致,借以评估3条基因对Na Cl胁迫的响应。实时荧光定量PCR结果表明,Bv M14-APX基因在200 m M Na Cl胁迫下叶和根中分别上调21.56、3.56倍;400 m M Na Cl胁迫下叶和根中分别上调51.27、11.47倍。Bv M14-DHAR3基因在200 m M Na Cl胁迫下叶和根中分别上调14.52、1.83倍;400m M Na Cl胁迫下叶和根中分别上调22.78、5.1倍。Bv M14-MDAR基因在200 m M Na Cl胁迫下叶和根中分别上调29.04、1.33倍;400 m M Na Cl胁迫下叶和根中分别上调59.3、3.81倍。3条基因在响应Na Cl胁迫过程中,叶中的表达量变化均显著于根,同时叶中转录水平与蛋白表达水平的变化具有一致性,说明这3条基因在抗氧化酶系统中起到了重要的作用,这也为进一步探究Bv M14-APX、Bv M14-DHAR3及Bv M14-MDAR基因间互作关系奠定了基础。     

盐胁迫下甜菜M14品系膜蛋白的提取和检验

盐胁迫是限制植物生长、降低植物产量的主要非生物胁迫之一,膜蛋白是盐胁迫时细胞最先受到危害的部位,且丰度低、疏水性强水溶性不好,且大部分膜蛋白存在糖基化、磷酸化等翻译后修饰,造成膜蛋白的微观不均一性,研究盐胁迫下膜蛋白的变化将有利于研究植物耐盐机制。甜菜M14品系是研究植物耐盐性的很好的材料,提取盐胁迫下甜菜M14品系叶片及根的膜蛋白,定量后进行Western Blot鉴定,检验膜蛋白的质量,为后续利用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术研究甜菜M14品系盐胁迫下差异表达膜蛋白质奠定基础。     

番茄SlWDR141基因的克隆及功能研究

为研究番茄WD40蛋白基因(SlWDR141)的功能,对SlWDR141蛋白进行生物信息学分析,发现SlWDR141蛋白在进化过程中高度保守,与土豆的同源性最高。在克隆SlWDR141基因全长序列的基础上,构建了亚细胞定位和酵母双杂交表达载体,证实SlWDR141蛋白主要定位在细胞核中,与DDB1具有相互作用。实时荧光定量PCR(real-time PCR)分析SlWDR141基因在组织中的表达谱,发现它在各个组织中均有表达,但在根中的表达量最高。为研究该基因的生物学功能,进一步构建了SlWDR141基因的干涉载体,用农杆菌介导法转化番茄得到转基因阳性番茄,荧光定量PCR鉴定出3个表达量下调的独立转基因株系。NaCl胁迫和Pst DC3000侵染野生型和转基因植株发现,转基因植株相对于野生型植株抗盐性和抗病性均下降,表明SlWDR141基因对盐胁迫和细菌侵染均起正调控作用。     

鸡尾酒δ整合策略构建表达三类纤维素酶的酿酒酵母工程菌株及初步评价

木质纤维素乙醇具有替代化石燃料的潜力,其生产过程包括生物质预处理、纤维素酶生产、水解和发酵等多个步骤。将纤维素酶生产、水解和发酵组合在一起的统合生物加工过程(consolidated bioprocessing,CBP)由于能降低水解和发酵成本而具有应用于纤维素乙醇生产的潜力,该技术的关键是构建能有效降解纤维素的工程菌株,而构建表达纤维素酶的酿酒酵母即是其中一种选择。采用鸡尾酒多拷贝δ整合的策略将7种纤维素酶基因(Trichoderma reesei cbh1、cbh2和egl2,Aspergillus aculeatus cbh1、egl1和bgl1)表达盒整合至酿酒酵母W303-1A染色体上,经4轮整合筛选得到菌株LA1、LA2、LA3和LA4。对这4个菌株进行纤维素酶活性测定,结果表明从LA1到LA3各种纤维素酶活性呈递增趋势,而LA4的酶活性与LA3的酶活水平相当。对菌株LA3进行酸碱预处理玉米芯料的发酵评价,结果表明:1在外加商品化纤维素酶的情况下,与对照菌株W303-1A和AADY相比,LA3能有效利用纤维素料发酵产醇;2与分步整合的菌株W3相比,发酵性能更优;3培养基中的营养成分影响菌株发酵性能。这些结果表明,鸡尾酒δ整合是一种有效的构建酿酒酵母CBP菌株的方法。     

酿酒酵母的甘油和乙醇生物合成对异丁醇产率的影响

通过过表达酿酒酵母异丁醇合成途径中的相关基因,以及缺失编码合成甘油和乙醇的关键基因,来提高异丁醇产率。过表达酿酒酵母异丁醇合成途径中,乙酰乳酸合酶(Ilv2)和支链氨基酸转氨酶(Bat2)并缺失编码甘油合成的关键基因GPD2得到菌株HZAL-13(YEplac181-PGK1p-ILV2ORF),其厌氧发酵异丁醇产率比出发菌株增加3.91倍;在HZAL-13的基础上进一步缺失乙醇合成途径中编码丙酮酸脱羧酶的关键基因PDC6,得到菌株HZAL-14(YEplac181-PGK1p-ILV2ORF),其厌氧发酵异丁醇产率较出发菌株增加8.97倍。研究结果表明减少副产物甘油和乙醇的生物合成有助于提高异丁醇的产率,利用基因工程方法缺失GPD2基因为提高异丁醇产率提供了新方向。     

甜菜BvBHLH92基因组织表达及亚细胞定位研究

BHLH蛋白家族是一类含有BHLH结构域,并广泛存在于植物中的一类重要转录因子。前期从甜菜中克隆得到了甜菜BvBHLH92基因,本研究对BvBHLH92基因的蛋白序列、组织表达及亚细胞定位进行分析。研究发现甜菜BvBHLH92蛋白包含225个氨基酸,并具有BHLH转录因子基因家族的典型功能结构域。同时,系统发育分析发现BvBHLH92蛋白与甜菜BvBHLH93及拟南芥At BHLH92亲缘关系较近。组织特异性表达检测表明BvBHLH92基因在甜菜花中表达量最高,而在根部位表达量最低,进一步研究发现BvBHLH92基因在甜菜根和叶部位响应盐胁迫诱导表达。此外,亚细胞定位分析证明BvBHLH92蛋白定位在细胞核,推测BvBHLH92蛋白在细胞核中调控相关基因的表达,进而调节甜菜对盐胁迫的响应变化。     

人组氨酸磷酸酶蛋白PHP14的过表达及其对NIH-3T3细胞体外增殖和非锚定依赖性生长的影响

目的:获取人组氨酸磷酸酶蛋白PHP14基因,并构建其N端和C端GFP融合的真核表达载体,建立过表达PHP14的NIH-3T3细胞系,并观察其对NIH-3T3细胞体外增殖和非锚定依赖性生长的影响。方法:以HeLa cDNA为模板,PCR扩增PHP14的全长编码基因,分别克隆到pEGFP-N2和pEGFP-C3载体中,构建pEGFP-N2-PHP14和pEGFP-C3-PHP14真核表达载体,利用脂质体将构建的载体转染到NIH-3T3细胞中,MTT法检测细胞增殖,软琼脂成集落法检测体外非锚定依赖性生长能力。结果:成功构建了过表达PHP14的真核表达载体pEGFP-N2-PHP14和pEGFP-C3-PHP14,并在NIH-3T3细胞中检测到了目的基因的过表达,PHP14在NIH-3T3细胞中过表达并不影响NIH-3T3细胞的体外增殖,但赋予了NIH-3T3细胞非锚定依赖性生长的能力。结论:成功构建了过表达PHP14的NIH-3T3细胞模型,在NIH-3T3细胞中过表达PHP14并不影响NIH-3T3细胞的体外增殖,但赋予了NIH-3T3细胞非锚定依赖性生长能力。     

毕赤酵母STE13基因敲除对GGH表达及其生物活性的影响

目的:重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-GGH表达的人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白[(GLP-1 A2G)2-HSA,GGH]的细胞活性测评结果显示生物活性较低,这可能与其表达过程中蛋白降解有一定关联。通过对毕赤酵母GS115 STE13基因的敲除,获得一株完整表达蛋白GGH的毕赤酵母宿主,并进一步提高其表达产物GGH的生物活性。方法:采用基于PCR技术介导的Cre-Loxp系统重组技术成功敲除宿主菌GS115的STE13基因,得到一株STE13缺陷型菌株GS115/D13,并通过细胞活性测评系统检测GS115/D13表达产物GGH的生物活性。结果:通过对STE13基因缺陷型菌株GS115/D13与出发菌株GS115/W发酵表达对比,显示GS115/D13菌株表达融合蛋白GGH生物活性有明显提升,且表达量提高了25.8%,两菌株生长无明显差异。结论:STE13基因的敲除成功缓解了GGH表达过程中的降解问题,并相对出发菌株GS115/W大幅度提高了蛋白生物活性。     

O-14办公楼

Jesse Reiser和梅本菜菜子从1986年开始在纽约市成立了RUR建筑师事务所。RUR事务所已经成长为一个国际公认的建筑公司，涉及到的项目也是很广泛：从家具设计、住宅和商业建筑．到景观设计和基础设施。Jesse Reiser现担任普林斯顿大学的教授。