黄花烟草K^＋通道基因NKC1克隆与序列分析

通过已知生物钾通道蛋白保守序列分析,设计兼并引物对钾饥饿处理的烟草幼根总RNA的反转录产物进行PCR扩增,分离到K^＋通道基因NKC1,该基因的cDNA阅读框由2481个核苷酸组成,编码的蛋白含有826个氨基酸（分子量为94.6KD）,等电点为6.60;将核苷酸序列输入NCBI进行BlastX其同源序列大部分为高亲和K＋转运体,与该基因同源性最高的是Solanum tuberosum钾通道基因SKT1,其氨基酸同源性为79%,预测该蛋白具有6个跨膜区域,采用同源模建方法预测了NKC蛋白活性区域的3维结构。同时,特异性转录分析发现NKC1基因在烟草幼根、叶片和花各器官均有表达,而以幼根组织中转录量最多;缺钾处理可显著诱导根系中NKC基因的转录,而高浓度NH4^＋处理对该基因的转录具有抑制作用,证实NKC基因在黄花烟草的钾吸收过程中起着重要作用。     

烟草钾离子通道基因NKT5的克隆和序列分析

本研究运用已经获得的1条490bp的普通烟草钾离子(K~+)通道基因的中间片段来设计特异性引物,应用RACE方法获得其3'和5'末端cDNA序列。通过三段cDNA序列拼接结合全长克隆测序验证,获得一个未报道的普通烟草K~+通道基因,并将其命名为NKT5(NCBI登录号为HM010922)。NKT5的cDNA全长为2365bp,其中5'端非编码区190bp、3'端非编码区249bp、编码区1926bp,编码641AA。对该基因进行了序列分析及功能预测,为进一步阐明其在烟草吸钾及抗逆过程中的功能及分子机制奠定了基础。     

酿酒酵母转氨酶Ⅰ基因的克隆及序列分析

利用酿酒酵母YT0801的总DNA为模板,采用PCR技术克隆出转氨酶I基因的DNA序列,利用生物信息学工具对其核酸序列和蛋白序列进行分析。测序结果表明DNA序列含有一个1503bp的开放阅读框,编码500个氨基酸,推测等电点为5.81,相对分子质量为56.2ku。同源性比对结果显示,该基因及推测的氨基酸序列与已报道的ARO8基因（Gen Bank Accession No:NM 001181067.1）的同源性均为100%。此外,对其理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、二级结构和三级结构进行了分析。该基因的成功克隆,为其功能研究和生物合成2-苯乙醇提供了分子基础。      

烟草MADS-box家族基因保守片段的克隆与序列分析

MADS-box家族基因在植物的生长发育过程中具有重要功能。在烟草生产中出现的早花现象与MADS-box家族基因相关,为了能从烟草中克隆出与开花时间相关的基因,根据不同植物MADS-box家族基因的保守区序列,设计简并引物,采用RT-PCR技术从烟草品种NC82茎尖中成功分离出27条cDNA片段,长度在122～146 bp之间。序列分析表明,其中有16条具有MADS_MEF2类保守结构域,其推导的氨基酸序列与拟南芥等MADS-box家族基因具有同源性,相似性平均能达到76%,并具有15个保守的氨基酸位点,其中7个位点参与蛋白与DNA的相互作用,4个位点具有蛋白二聚化功能。系统发育分析结果表明,这些保守片段分别和拟南芥9个不同的MADS-box家族基因亚类最近似,其中许多亚家族与成花相关,说明NC82中存在具有调控开花的MADS-box家族基因表达,并可能与NC82低温敏感,易早花特性相关。     

烟草转录因子bHLH93基因的克隆及表达分析

碱性/螺旋-环-螺旋(basic/helix-loop-helix,b HLH)转录因子是一类广泛存在于真核生物体内的重要转录因子,能够参与调控植物体多种生理途径。为了明确b HLH转录因子在烟草中的功能和调控机制,通过同源克隆技术从烟草中克隆到一个b HLH转录因子基因(Ntb HLH93),并结合生物信息学和基因表达模式分析进一步预测其生物学功能。结果表明:Ntb HLH93 c DNA序列长1 254 bp,包含一个长度为1 047 bp的开放阅读框,编码349个氨基酸。Ntb HLH93属于疏水性蛋白,其二级结构中的主要结构元件是α-螺旋和无规则卷曲,三级结构中具有b HLH家族典型的螺旋-环-螺旋结构特征。Ntb HLH93基因表达具有明显的组织特异性,主要在烟草不同生育期侧根和盛花期子房组织中高表达,这与植物甾醇集中在生长分裂旺盛组织中合成的特征相吻合。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因的克隆和序列分析

依据宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001木聚糖酶(XynII)N末端氨基酸残基序列以及曲霉菌密码子的偏爱性和真核生物mRNA在3′端存在Poly(A)等所提供的生物信息,采用RTPCR技术扩增了XynII成熟肽和3′非编码区的cDNA片段,PCR产物直接克隆至pUCmT载体中。DNA序列分析表明,该cDNA全长733bp,其中3′非编码区178bp,成熟肽编码区555bp,编码184个氨基酸。成熟肽基因推导的氨基酸序列同Aspergillusniger、Emericellanidulans以及Trichodermaviride来源的木聚糖酶相比,同源性分别为89%、46%和36%。又进一步对XynII二级结构进行了分析,并通过SWISSMODEL预测了XynII的三维结构。     

碳纳米溶胶对烟草K+通道基因表达及根系K+流速的影响

为解析碳纳米溶胶促进烟草钾素吸收的生理机制,利用砂培试验和非损伤微测技术(Non-invasive micro-test technology,NMT),研究了碳纳米溶胶对4个烟草品种K+通道基因表达、根系K+流速、植株钾素吸收和积累的影响.结果表明:碳纳米溶胶能促进烟草K+内流通道基因的表达,促进K+内流,抑制K+外...     

嗜热链球菌胸苷酸合成酶基因的克隆与序列分析

本研究以嗜热链球菌(S．thermophilus)染色体DNA为模板,利用PCR技术扩增出胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,thyA)基因,将其克隆入T载体中,转化DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行酶切鉴定,PCR扩增鉴定,进行测序,与已知序列进行同源性比较,结果表明成功克隆了thyA基因,全长900bp,与国外报道的S．thermophilus ATCC19258 thyA基因同源性达99．9%。这为构建以thyA基因为选择压力的非抗生素抗性载体提供了理论依据。     

钝裂银莲花Actin基因片段的克隆与序列分析

提取钝裂银莲花叶片中的基因组DNA,用来克隆其Actin基因序列片段,为研究其生理功能及其他基因在钝裂银莲花中的表达和调控奠定基础。根据GenBan中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保守序列设计简并引物。以钝裂银莲花叶片总DNA为模板,利用RT—PCR技术获得了3个Actin基因片段。序列分析表明,3个Actin基因片段长为780bp,含有一段内含子,第一段外显子编码128个氨基酸,具有2个Actin基因的功能位点;与其他植物同源序列进行分析表明,其核苷酸序列同源性在81%-90％之间,氨基酸序列同源性在95％-100％之间。第二段外显子编码84个氨基酸,与其他植物同源性序列进行分析表明其氨基酸序列同源性在94％-99％之间。本研究中得到的3个基因序列是Actin基因的同源片段,分别命名为AOACTI,AOACT2,AOACT3。     

黑曲霉 G-1125生淀粉糖化酶基因的克隆与序列分析

从黑曲霉Aspergillus niger G-1125克隆到了生淀粉糖化酶菌基因的DNA及cDNA序列。序列分析表明,该生淀粉糖化酶基因组DNA 序列编码区长2 172 bp,cDNA编码区长1 923 bp,该基因含有4个内含子,共编码640个氨基酸,前18个氨基酸为信号肽序列,该氨基酸序列中共含有2个潜在的糖基化位点,软件预测出该酶的分子质量约为68 ku,等电点为pH值4.07。     

烟草NtSnRK2.1基因的克隆及其在非生物胁迫

植物SnRK2基因家族(蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族2, Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase 2)在糖代谢和抗逆信息传递途径中发挥重要作用。本研究从普通烟草腺毛cDNA文库中筛查烟草SnRK2基因的EST序列,以此序列为信息探针,通过电子克隆和RT-PCR的方法从烟草中克隆到一个包含1017 bp开放阅读框、编码338个氨基酸的cDNA序列,命名为NtSnRK2.1。生物信息学分析表明,NtSnRK2.1蛋白同时具有磷酸化丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸的活性。氨基酸序列比对发现,NtSnRK2.1与拟南芥、水稻和小麦等植物中受逆境胁迫诱导表达的直系同源基因高度同源。组织表达分析结果显示,烟草NtSnRK2.1基因的组织表达差异较大,在根部的表达量最高,其次是叶片,茎部的表达量最低。胁迫处理下的基因表达分析结果表明,NtSnRK2.1受高盐、高渗、低温胁迫和ABA处理诱导表达,对各胁迫条件的应答模式不同,其对各胁迫条件的敏感度为:高渗＞高盐＞低温＞ABA。      

烟草类胡萝卜素异构酶基因的克隆及功能研究

为了进一步研究烟草类胡萝卜素异构酶（Carotenoid isomerase,CRTISO）基因的功能,从普通烟草（Nicotiana tabacum）的cDNA中成功克隆出CRTISO基因编码区（CDS）全长,长度为1716 bp,Blast结果显示与马铃薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）的前番茄红素异构酶（Prolycopene isomerase）基因的相似度达93%。将CRTISO基因的部分序列插入烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体中,构建重组载体pTRV2-CRTISO。通过TRV病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）系统抑制本氏烟草（Nicotiana benthamiana）CRTISO基因的表达,同时利用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测CRTISO下游基因的表达量变化。结果表明,与对照组相比,TRV-CRTISO载体侵染的烟草叶片出现黄色斑点;CRTISO基因的沉默导致下游番茄红素ε环化酶（ε-LCY）、番茄红素β环化酶（β-LCY）和胡萝卜素β-环羟化酶（β-OHase）基因表达量降低。对烟草CRTISO基因功能的研究有助于揭示烟草中类胡萝卜素合成代谢途径的调节机制,为选育优质烟草品种奠定理论基础。      

烟草CONSTANS同源基因的克隆与分析

日照长度影响植物的生长发育,在拟南芥中CONSTANS是植物光周期开花途径中的关键基因。利用同源序列法结合RACE 技术从短日照烟草品种Kutsaga.Mammoth10 中分离出了开花时间相关的CO(CONSTANS)同源基因,并命名为NtCO1(基因登录号JN022535.1)。经序列分析,NtCO1 全长1493 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,81~1292 bp),编码403 个氨基酸;具有CO 蛋白典型的结构域;氨基末端有两个B-box 结构,羧基末端有CCT 保守结构域。氨基酸同源性比对发现,NtCO1 与茄科CO 同源蛋白一致性最高,同马铃薯CO 序列一致性达到86.5%;与拟南芥CO 蛋白和水稻Hd1 氨基酸序列一致性也分别达到50%和43.7%。基因表达分析表明,NtCO1在叶片中优势表达,茎中次之,根中最弱     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的克隆及分析

采用RACE技术,从烟叶中克隆了一个新的编码GGPPS蛋白的基因,命名为Ntggpps3,并对其进行了生物信息学分析。Ntggpps3的cDNA序列为1251 bp,包含一个长度为1092 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸。NtGGPPS3蛋白与其他植物GGPPSs高度保守。生物信息学预测结果表明,NtGGPPS3的分子量为39.5 kD,等电点为6.28,为亲水性蛋白,N端有叶绿体信号肽。二级结构主要由螺旋和无规则卷曲组成,三级结构含有两个富含天冬氨酸的区域,并通过同源建模构建了NtGGPPS3的3D模型。进化分析表明,植物的GGPPS分为大亚基和小亚基两个分支,而且NtGGPPS3属于大亚基。     

普通烟草NtNDPK4基因的克隆与表达分析

为揭示核苷二磷酸激酶在烟草中的功能和作用机制,从烟草K326克隆获得了1个核苷二磷酸激酶基因并命名为NtNDPK4,CDS长度为678 bp,编码225个氨基酸。生物信息学分析表明,NtNDPK4蛋白分子量大小24.95 kDa,pI约8.34,亚细胞定位预测在叶绿体上,进化分析显示该蛋白属于NDPKⅡ型,顺式作用元件分析预测该基因启动子含有激素和光照响应的作用元件。组织表达特异性分析结果显示,NtNDPK4在烟草各组织中均有表达。在MeJA、ABA、GR-24、IAA、GA和6-BA等激素处理下,NtNDPK4基因的表达显著上调,尤其是GA处理后NtNDPK4基因表达上调了近50倍。黑暗生长的烟草幼苗恢复光照24 h后,NtNDPK4基因表达明显上调。这表明烟草NtNDPK4基因可能参与激素和光照响应。     

烟草Mlo基因的克隆及其序列特性分析

Mlo基因家族是一类植物抗病的负调控因子,该基因的突变能产生广谱的抗病性。以GenBank公布的水稻Mlo基因序列(登录号:AK099399.1)为信息探针对烟草的EST数据库进行同源搜索,并将获得的同源性高的EST序列进行拼接,最后得到了烟草Mlo基因的cDNA序列。采用RT-PCR方法成功克隆了与预期大小一致的Mlo基因cDNA片段951 bp,该基因可编码304个氨基酸。采用生物信息学方法预测分析了该基因编码蛋白的一、二级结构,并对其功能进行了预测。结果表明,该烟草Mlo基因编码蛋白包含有一个保守的Tmemb_40结构域,可能是一种类似于植物G蛋白偶联受体的膜结合转运蛋白。     

烟草类胡萝卜素双加氧裂解酶基因的克隆与序列分析

为揭示类胡萝卜素双加氧裂解酶基因(CCDs)在烟草生长发育过程中的功能,通过RT-PCR技术克隆到烟草的类胡萝卜素双加氧裂解酶4基因(NtCCD4),编码区1806 bp,编码601个氨基酸,基因序列提交NCBI,GenBank登录号为JF947192.根据氨基酸组成对NtCCD4基因编码蛋白的疏水性/亲水性、蛋白结构及进化关系等进行预测和分析.结果表明:烟草NtCCD4基因编码的蛋白分子量为65936.3 Da,等电点为6.58,定位在叶绿体膜上,为一个稳定的亲水性蛋白;二级结构预测显示此蛋白结构以无规则卷曲(57.4％)为主,α螺旋(13.31％)和β转角(6.61％)所占比例相对较少;进化分析表明NtCCD4是类胡萝卜素双加氧裂解酶基因( CCDs)家族中的一个成员,与其他物种的CCD4蛋白比较显示NtCCD4编码的蛋白含有多个保守区域,其中4个组氨酸残基是组成蛋白功能域所必须的,它们与Fe2+结合共同组成蛋白酶的活性中心.     

普通烟草抗渗透胁迫基因NtP5CS的克隆与表达分析

从普通烟草中克隆脯氨酸合成的关键酶基因P5CS,分析其序列特征、进化关系、表达模式,以期为烟草的抗逆研究奠定基础。设计兼并引物获得P5CS基因中间片段,利用RACE技术扩增其全长cDNA;采用生物信息学技术分析该基因的序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用RT-PCR研究其表达模式。从受干旱胁迫诱导的普通烟草品种中烟14中克隆到全长为2584bp的烟草P5CS基因,命名为NtP5CS,GenBank登录号为HM854026,开放读码框为2160 bp,编码719个氨基酸。经Blast同源性比对分析,该序列与番茄tomPRO2基因在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。系统进化树分析显示,NtP5CS与番茄tomPRO2基因可能是直系同源基因。RT-PCR分析表明,干旱、低温、ABA、高盐等胁迫条件均可诱导NtP5CS基因的上调表达,且在旺长期和胁迫条件下根和叶中表达量最高。首次从普通烟草中克隆得到P5CS基因,该基因对水分胁迫响应,可能参与普通烟草抗渗透胁迫反应。     

微小毛霉凝乳酶基因的克隆与表达

微小毛霉(Mucor pusillus)凝乳酶是微生物凝乳酶的主要来源之一,但与传统的牛凝乳酶比较具有一定的缺陷。为将其采用基因工程的方法进行改造获得理想的凝乳酶,本研究克隆到微小毛霉凝乳酶基因,将其插入原核表达载体pTWlN1中,使之与几丁质结合域(CBD)一内含肽(intein)融合,获得原核表达质粒pTWIN1/M。转化大肠杆菌BL21(DE3),后经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析,获得了重组蛋白。     

烟草非特异性脂质转移蛋白基因的克隆与表达分析

为了阐明非特异性脂质转移蛋白基因Nt LTP1.1在烟草抗病抗逆反应中的功能,用c DNA末端快速扩增技术(Rapid-amplification of c DNA ends,RACE)从普通烟草中克隆了该基因全长,并通过生物信息学方法分析了c DNA序列结构、蛋白理化性质、保守基序、三级结构以及系统进化关系;利用q RT-PCR检测了该基因在不同组织中的表达模式以及胁迫条件下的表达差异。结果表明:Nt LTP1.1基因全长615 bp,编码蛋白含有129个氨基酸,为一种小分子碱性可溶性蛋白。蛋白序列N端含有信号肽,预测其可能定位于分泌途径中。Blast比对结果显示,烟草非特异性脂质转移蛋白与番茄ns LTP1序列相似性最高,含有8CM保守基序(8个半胱氨酸残基组成的保守基序)。蛋白三级结构预测表明,Nt LTP1.1具有ns LTP典型的三级结构,包括4个α-螺旋,4对二硫键,1个可结合和容纳脂质分子的疏水腔。多重比对结果显示,Nt LTP1.1 8CM结构域模式为C1-X9-C2-X13-C3C4-X19-C5XC6-X22-C7-X13-C8。系统进化分析结果表明,ns LTP进化形成5类,Nt LTP1.1属于Type I。表达模式分析显示,Nt LTP1.1基因主要在烟草叶片中表达,具有明显的组织表达特异性。在低温胁迫条件下表达受到抑制,在水杨酸诱导条件下表达上调。因此,推测Nt LTP1.1基因可能在烟草防御反应中发挥作用。