N+离子注入诱变筛选胸腺嘧啶缺陷型大肠杆菌

利用N+离子注入诱变大肠杆菌,经甲氧苄啶的选择性筛选,得到胸腺嘧啶营养缺陷型菌株.通过重组DNA技术将该突变株胸苷酸合成酶(TS)基因连接到载体pMD-18T质粒上,经测序发现TS基因第173个碱基由AT→CG,其相应的氨基酸由谷氨酸(E58)突变为丙氨酸(A58).该突变株的获得为后续研究嘧啶核苷酸的代谢奠定了基础.     

绿色化工新例—利用基因重组蓝细菌生产PHB的初步结果

在发现蓝细菌糖原合成与PHB合成相竞争的基础上，提出用基因工程手段改造蓝细菌，使催化糖原合成的关键酶?ADP-葡萄糖焦磷酸羧化酶的agp基因部分为红霉素抗性基因所取代，从而将与PHB合成形成竞争反应的糖原合成途径删除. 对该突变株的构建过程及培养进行了初步研究，所得突变株生长速度提高，最终生物量较野生株高，表明突变株细胞的光合效率较野生株细胞提高. 在突变株体内未检测到糖原，光合自养时PHB含量由野生株的3.4%提高到约15%.     

四川地区宫颈癌患者组织中部分高危HPV亚型感染及E6基因序列分析

目的调查四川地区宫颈癌患者组织中高危人乳头瘤病毒(HPV)33、52和58亚型的感染状况及E6基因突变特性,为制备适合中国人群的HPV疫苗提供流行病学资料。方法采用PCR技术,并结合基因测序分析。结果对四川地区2003~2004年60份宫颈癌患者癌组织DNA进行HPV检测,获得HPV52和HPV58亚型各4份,检出率为6·7%;HPV33亚型1份,检出率为1·7%。对所获得的各份HPV33、52和58E6基因测序,均有碱基突变。结论HPV52型感染率在四川地区相对较高。与GenBank标准株相比,四川地区发现的HPV33和HPV52E6基因有多处突变,与日本发现的HPV33和HPV52突变株相近。     

2017年云南省登革病毒Ⅰ型分离株NS1基因的鉴定及分析

目的鉴定并分析2017年云南省登革病毒Ⅰ型(dengue virusⅠ,DENVⅠ)分离株的NS1基因。方法采用病毒RNA提取试剂盒提取登革热(dengue fever,DF)患者血清RNA,RT-PCR法鉴定病毒类型,并扩增DENVⅠ的NS1基因,进行测序。应用BIOEDIT软件比对NS1及DENVⅠ标准株(DQ672562.1)的核苷酸及氨基酸序列,并进行突变分析。应用MEGA 5.1软件中的NJ法(1000 Boot strap replicate)构建NS1基因的系统进化树。结果共分离获得16株DENVⅠ的NS1基因,经比对发现,201703、201704、201708、201709、201713分离株NS1基因第21位碱基由C变为T(无义突变);201705、201706、201712分离株NS1基因第289位碱基由T变为A(有义突变),氨基酸曲L变为M。16株分离株NS1基因其他突变位点均相同,共85处发生碱基突变,其中5个为有义突变。16株分离株与2011-China Donggua(JQ048541.1)、2008-Singapore(GU370049.2)、2014-Taiwan(KU365900.1)、2005-China Fujian(DQ193572.1)、2016-Malaysia(KX452065.1)、2007-Indonesia(KC762646.1)、2015-South Korea(KP406802.1)、2006-Japan(AB178040.1)、2007-Thailand(HM469966.1)、2013-singapore(KJ806945.2)有较近的亲缘关系。结论 2017年云南省16株分离毒株均为DENVⅠ,可能属于东南亚国家的输入性毒株。     

应用等位基因特异性扩增法快速检测结核分支杆菌对利福平的耐药性

目的　建立一套等位基因特异性扩增 (ASA)的检测体系 ,用于结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测。方法　根据结核分支杆菌野生型基因设计ASA特异性引物 ,ASAPCR扩增 39株结核杆菌利福平耐药株的rpoB基因 ,经琼脂糖凝胶电泳检测 ,进而推断利福平的耐药性 ;同时进行DNA序列测定以验证ASA法的检测结果 ,并分析上海地区结核杆菌rpoB基因的突变特点。结果　在 39株利福平耐药株中共检出 36株 ,敏感性为92 3% ;与DNA测序结果的符合率为 87.2 % ,并鉴定了 11种不同类型的 4 1种突变形式 ,其中包括 9种点突变和 2种基因缺失。结论　用等位基因特异性扩增法分析结核分支杆菌的rpoB基因突变具有较高的特异性与敏感性。该法快速、简便、可靠 ,可应用于临床利福平耐药性的检测。     

狂犬病病毒CTN株反向遗传系统的改造及拯救

目的对狂犬病病毒CTN株反向遗传系统进行改造,并拯救改造后的狂犬病病毒。方法应用基因定点突变技术分别对狂犬病病毒CTN株G蛋白的第194位和333位氨基酸进行定点突变,将突变后的G蛋白基因替换原有反向遗传系统中的G蛋白基因,同时对突变后的G蛋白基因进行拷贝,分明构建含有1、2和3个改造后G蛋白基因全长序列的感染性克隆,并将其分别与辅助质粒共转染BSR细胞,采用直接免疫荧光实验(DFA)和RT-PCR法鉴定重组病毒。结果 G蛋白的第194位天冬酰胺突变为丝氨酸,第333位谷氨酰胺突变为谷氨酸,获得含有1、2和3个突变后G蛋白基因的狂犬病病毒CTN株反向遗传系统,并拯救出重组狂犬病病毒。结论成功对狂犬病病毒CTN株反向遗传系统进行了改造,并拯救出了重组病毒,为研制安全、稳定、高效的新型狂犬病病毒疫苗奠定了基础。     

MBL EXON Ⅰ 54位基因突变检测方法的建立及初步应用

目的 建立MBL基因点突变的检测方法,探讨健康汉族人MBL 54位密码子基因突变的情况。方法 根据MBL基因序列设计引物,建立MBL的PCR-RFLP测定点突变的方法。结果 扩增产物测序结果与预期扩增的目的基因序列一致,检测灵敏度为80ng/ml,用其检测58例健康献血员54位密码子的点突变情况,野生型为29例,占50％;突变杂合型为27,占46.55％;突变纯合子型为2例,占3.45％。基因频率A为0.732 8;B为0.267 2。结论 该方法是特异、灵敏的检测方法。     

MBL EXONⅠ54位基因突变检测方法的建立及初步应用

目的建立MBL基因点突变的检测方法,探讨健康汉族人MBL 54位密码子基因突变的情况.方法根据MBL基因序列设计引物,建立MBL的PCR-RFLP测定点突变的方法.结果扩增产物测序结果与预期扩增的目的基因序列一致,检测灵敏度为80ng/ml,用其检测58例健康献血员54位密码子的点突变情况,野生型为29例,占50%;突变杂合型为27,占46.55%;突变纯合子型为2例,占3.45%.基因频率A为0.732 8;B为0.267 2.结论该方法是特异、灵敏的检测方法.     

结核病药效评价用结核分枝杆菌参考菌株的筛选

目的筛选结核病(tuberculosis,TB)药效评价用结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)国家参考菌株。方法取169株MTB临床分离株,采用结核杆菌生长指示管(mycobacterial growth indicator tube,MGIT)960液体培养基,对4种一线抗TB药物[链霉素(streptomycin,STR)、异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampin,RFP)和乙胺丁醇(ethambutol,EMB)]进行药敏试验,并对耐INH和/或耐RFP的菌株的相关耐药基因位点进行测序,确认突变位点;用间隔区寡核苷酸分型法(Spoligotyping)对所有菌株进行基因分型,多位点可变数量串联重复序列分型方法(mutiple loci VNTR analysis,MLVA)对北京家族MTB临床分离株进行基因分型。结果 169株MTB临床分离株中耐STR 118株,INH 143株,RFP 129株,EMB 95株,耐多药(至少对NIH和RFP耐药)120株,单耐INH 5株,单耐RFP7株,四种抗TB药均敏感共11株。143株INH耐药菌株中,kat G基因突变菌株占76.9%,inh A基因突变菌株占27.3%,aph C基因突变菌株占25.2%,至少2个基因发生突变的菌株有31株;129株RFP耐药菌株中,rpo B基因531位点发生突变,占67.4%,526位发生突变,占17.8%,516位点发生突变,占16.3%,至少2个位点发生突变的菌株有10株。169株MTB临床分离株分为北京家族和非北京家族,北京家族111株;非北京家族58株,主要有CAS家族2株,EAI家族7株,H家族11株,LAM家族6株,MANU家族6株,T家族7株,U家族1株,X3家族3株,还有15株在数据库中未表现的新基因型。111株北京家族MTB临床分离株分为4大群,其中Ⅱ群分布最广,占68.5%,代表性最好。筛选出耐多药菌株27株,敏感菌株5株,单耐异烟肼2株,单耐利福平3株。结论成功筛选出敏感菌株、单耐药菌株、MDR菌株作为候选菌株。     

结核杆菌利福平与异烟肼耐药基因快速检测用参考品的制备

目的建立结核杆菌利福平与异烟肼耐药基因快速检测用国家参考品。方法收集分枝杆菌菌株,用经典的药敏试验及培养基鉴别试验进行鉴定;用分子生物学技术对耐药菌株的耐药基因进行核苷酸序列分析,并进行突变位点的筛选;选取完全耐药菌株,用膜过滤法制备单细胞菌液,进行显微计数。结果选出阳性参考品符合率检测用、含不同突变位点的结核分枝杆菌耐药菌株20株;阴性参考品符合率检测用菌株10株,其中敏感菌株5株,致病性非结核分枝杆菌菌株5株;最低检出量检测用结核分枝杆菌耐药菌株5株,制备浓度为1×106个/ml的单细胞菌液。结论该参考品可以用作结核菌利福平与异烟肼耐药基因快速检测试剂质量的标准。     

水痘-带状疱疹病毒84-7株基因特征分析

目的 分析水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)84-7株的基因特征。方法 利用PCR法分别扩增VZV84-7株ORF38(PstⅠ)、ORF54(BglⅠ)、ORF62(SmaⅠ、Bss HⅡ、NaeⅠ)共5个酶切位点片段,运用生物信息学软件对5个酶切位点进行分析;PCR扩增病毒复制起点,分析VZV84-7株复制起点特征;PCR扩增VZV84-7株g E基因,对该基因进行序列分析。结果 VZV84-7株的酶切位点特征为:PstⅠ~+BglⅠ~+SmaⅠ~-Bss HⅡ~-NaeⅠ~-;复制起点区域包含1个13TA+19GA结构;g E基因序列与Oka株相比,在第1 170位存在1个碱基差异,为C→A,属于无义突变,但编码区氨基酸序列同源性为100%。结论 VZV84-7株的酶切位点和复制起点均有特异性,同时VZV84-7株与Oka株的g E基因仅有1个碱基突变,氨基酸序列同源性为100%。     

甲基嘧啶磷的绿色合成研究

以嘧啶醇和碳酸钾水溶液在有机溶剂中反应减压脱水,生成嘧啶醇钾盐与甲基氯化物进行缩合反应,经过滤、减压浓缩得到甲基嘧啶磷。优化的反应条件为：以甲苯为溶剂,n（嘧啶醇）∶n（碳酸钾）=1.0∶2.0,嘧啶醇钾盐含水量<0.1%,反应温度30～40℃,反应时间6 h。优化条件下,甲基嘧啶磷纯度98.5%,收率92.6%,该工艺转化率高、收率高、三废少,符合绿色环保生产理念,具有工业化应用前景。     

1株致病性黄疸出血群钩端螺旋体病流行菌株与其同血清群疫苗株的比较基因组学分析

目的 对1株致病性黄疸出血群钩端螺旋体（简称钩体）病流行菌株与其同血清群疫苗株进行比较基因组学分析。方法 应用高通量测序技术对黄疸出血群钩体流行株200502（简称流行株200502）进行全基因组序列测定,并与其同血清群疫苗株56601进行比较基因组学分析;选取GenBank中已公布的包括疫苗株56601在内的9株不同基因种的代表性钩体菌株构建系统发育进化树。结果 流行株200502全基因组序列全长为4 543 190 bp,含有编码基因3 580个,其中具有直系同源簇（clusters of orthologous groups,COG）功能2 192个。流行株200502与疫苗株56601基因组平均核苷酸一致性为99.2%,存在共有基因3 245个,流行株200502含有特有基因242个。以疫苗株56601为参考,在流行株200502中共鉴定出2 005个插入缺失（indel）和19 799个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）位点,其中编码区有8 485个同义SNP位点、3 484个非同义SNP位点,涉及菌株的细胞运动、信号转导机...     

BRD-Ⅱ风疹病毒疫苗株的连续传代及其基因稳定性

目的观察上海生物制品研究所有限责任公司BRD-Ⅱ风疹病毒株(S-BRD-Ⅱ株)在MRC-5细胞中连续传代的基因稳定性,并比较该毒株与其他上市风疹毒株E1基因的差异。方法将S-BRD-Ⅱ株病毒在MRC-5细胞中连续传10代,检测每代病毒的培养特性和E1基因序列,第28、29、33和38代病毒的ORF序列及第28、38代病毒的5′-和3′-末端序列,同时测定B-BRD-Ⅱ株(北京天坛)及进口疫苗风疹病毒株(RA 27/3)E1基因,并对各基因的核苷酸及其相应的氨基酸序列进行分析。结果 S-BRD-Ⅱ株病毒在MRC-5细胞上连续传10代,其培养特性、细胞病变(CPE)程度及病毒滴度基本稳定,S-BRD-Ⅱ株病毒E1基因未发生变异,与Gen Bank中登录的BRD-Ⅱ株比较,有一个特异性的沉默突变,与RA 27/3疫苗株病毒比较,有122个核苷酸位点及其相应6个氨基酸发生突变。第28、29、33、38代S-BRD-Ⅱ株病毒的ORFⅠ和ORFⅡ基因区域与Gen Bank登录的BRD-Ⅱ株病毒比较,有5个位点发生变异,且P150非结构蛋白编码区域基因出现大片缺失。第28和38代S-BRD-Ⅱ株病毒的5′-末端与Gen Bank中登录的BRD-Ⅱ株序列的5′-末端一致,而3′-末端有一个氨基酸发生突变。结论 BRD-Ⅱ风疹病毒疫苗株在MRC-5细胞中具有良好的传代稳定性,所有上市风疹病毒株的E1基因氨基酸序列差异不大。     

四、生活橡胶制品和胶乳制品

可减少轮胎噪音的柔性聚氨酯海绵 PCT Int．Appl．WO 2007 58 311（C1．B60C5／00） 本海绵胶可置于轮胎和轮辋之间隙之中，其密度7～40kg／m^2，撕裂强度（TS）每单位密度（kg／m^3）为≥0．30N／cm。将海绵胶固定在环形带状零件上，可起到降低噪音的作用。     

代谢工程改造大肠杆菌生产琥珀酸

琥珀酸（succinic acid）是一种四碳二羧酸,在食品、医药、塑料和化工行业具有广泛的应用。目前,微生物法生产琥珀酸存在得率低、生产强度低、副产物积累等问题。为此,本研究通过复合诱变（ARTP和⁶⁰Co-γ射线）筛选到一株耐高渗突变株FMME-N-2,其琥珀酸得率为0.70g/g葡萄糖,同时积累18.8g/L乳酸、7.6g/L甲酸和17.3g/L乙酸。为了提高琥珀酸得率,通过敲除乳酸脱氢酶基因（ldhA）、丙酮酸-甲酸裂解酶-甲酸转运蛋白基因（pflB-focA）、磷酸转乙酰基基因（pta）、丙酸激酶基因（tdcD）和a-酮丁酸甲酸酯裂解酶基因（tdcE）,阻断冗余代谢支路减少副产物积累,获得工程菌株FMME-N-13,琥珀酸得率增加到0.92g/g葡萄糖,同时副产物大大降低,积累0.6g/L乳酸、3.6g/L甲酸和12.3g/L乙酸。同时,通过调控RBS强度组合优化来自产琥珀酸放线杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因（AsPCK）和来自博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因（CbFDH）的表达水平,调控胞内ATP和NADH的浓度,最优工程菌FMME-N-26（FMME-N-13-L-AsPCK-L-CbFDH）的琥珀酸得率增加至1.04g/g葡萄糖,仅积累5.5g/L乙酸;最终,对厌氧阶段葡萄糖浓度进行优化,当葡萄糖浓度控制在0~5g/L时,菌株FMME-N-26的琥珀酸浓度增加到111.9g/L,得率为1.11g/g葡萄糖（理论产率的99%）,生产强度为1.76g/L/h,为琥珀酸的工业化生产奠定了良好的基础。     

Ⅰ型聚酮类天然产物中利用点突变产生类似物的研究

点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化）,包括碱基的添加、删除、改变等。通过构建发生突变的质粒利用遗传转移的方法同源重组到野生型基因组中,使得氨基酸改变从而引起蛋白功能发生变化,获得鉴定正确的突变株后发酵筛选结构类似物。聚酮类天然产物在生物合成过程中,其聚酮链会发生若干步氧化还原反应,通过点突变的方法失活该蛋白,从而跳过该步氧化还原反应的作用,产生PKS骨架上的改变,从而得到结构类似物。     

石油脱硫菌 Gordonia sp. WQ-01激光诱变选育及关键酶DszC克隆表达分析

利用脱硫菌株Gordonia sp. WQ-01为出发菌株进行激光诱变育种,考察了不同照射时间和输出功率对菌株的正突变率影响,根据DszC酶活检测、序列比对、空间结构分析以及在大肠杆菌的异源表达研究了突变菌株的关键性能。结果发现,在最适宜诱变条件下（激光照射15 min、输出功率20.0 mW）获得脱硫效率提高28％［0.15 mmol/（L·h）］、有效脱硫时间缩短（36 h）的脱硫菌株,该菌株关键酶DszC活性提高了33.3%。此外,突变菌株脱硫基因dszC的核酸和氨基酸序列、二级结构和三级结构均发生了改变,从而导致酶活显著提高。dszC基因在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导后可以表达出45 kDa大小的DszC蛋白。     

巢式PCR-RFLP检测大便K-ras基因第12位密码子点突变

用巢式PCR－RFLP分析技术,扩增大便中K－ras基因第12位密码子所处的一段外显子,根据BstNI内切酶的多态性,分析K－ras基因第12位密码子是否突变。结果在22例结肠直肠癌患者的术后石蜡包埋组织中,检出10例（45.5％）K－ras突变,该10例患者中,有8例（36．4％）患者的术前大便中检出K－ras基因突变。这种方法快速、简便、特异、敏感,且可避免大便中多种物质对PCR的干扰。对可疑人群具有实际应用价值。     

新城疫病毒F_(48)E_8株HN基因的克隆和序列分析及与国外NDV HN基因的同源性比较

目的 克隆ＮＤＶ Ｆ４８Ｅ８株ＨＮ基因,与国外ＮＤＶ ＨＮ基因进行比较分析。方法 提取 ＲＮＡ,应用 ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出ＮＤＶ Ｆ４８Ｅ８株的全长ＨＮ基因,将该ＨＮ基因插入ｐＫＳ（－）后进行克隆并测序。结果 ＮＤＶ Ｆ４８Ｅ８株的ＨＮ基因核苷酸长度为１７１３ｂｐ,编码５７１个氨基酸,有５个糖基化位点,１２个极保守的半胱氨酸残基,与 国外发表的ＮＤＶ序列相符。结论ＮＤＶＦ１８Ｅ８株ＨＮ蛋白基因与国外发表的ＮＤＶ ＨＮ蛋白基因核苷酸同源性在 ８３．３％～８９．２％之间,推导的氨基酸同源性在８７．６％－９１．１％之间。