ARE-Nrf2荧光素酶报告细胞株KeraSens构建及其在皮肤致敏预测中的应用

用分子生物学和基因工程技术,构建含人GSTP1抗氧化反应元件（antioxidant response element,ARE）和荧光素酶报告基因的HaCaT基因工程细胞株——KeraSens致敏细胞株,用于化妆品原料的皮肤致敏性预测。通过对20种化学品进行测试,并将预测结果与已知LLNA数据进行比较,该细胞株预测皮肤致敏物的灵敏度为100%,特异度为62.5%,准确度为85%,初步证明KeraSens细胞株具有预测皮肤致敏物的能力。通过与DPRA和h-CLAT试验方法组合使用,能够准确识别皮肤致敏物,结果与已知人体数据高度一致。     

直接多肽反应试验在化妆品检测中的应用

以OECD指南为基础,在实验室建立直接多肽反应试验(DPRA)方法并进行实验室内验证,同时评估该方法对测试化妆品配方致敏反应的可能性。依据OECD TG 442C指南,将受试物(包括化学品和化妆水配方)分别与半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽以10:1和50:1的比例避光孵育24h,采用高效液相色谱法分析两种多肽的消耗,计算多肽消耗率并依据DPRA预测模型对受试物致敏性进行判定。由试验结果可知,DPRA可准确区分16种化学品的致敏性,检测结果与OECD TG 442C指南及文献中小鼠淋巴结试验(LLNA)结果一致;DPRA对3种化妆水配方检测结果分别为致敏物、致敏物、非致敏物,与多肽反应程度分别为中、低和无。     

采用DPRA替代方法评价3种香料的皮肤致敏性

采用直接肽反应试验(DPRA)对新铃兰醛、氯化苔黑醛和苔黑醛3种香料的致敏性进行评价.在本实验室建立DPRA方法,采用高效液相色谱仪测定新铃兰醛、氯化苔黑醛和苔黑醛及其他6种已知致敏性化合物的多肽消除率,并进行皮肤致敏性的预测判定.通过比较DPRA和小鼠局部淋巴结试验(LLNA)结果的一致性,判断方法的可行性,并最终判...     

皮肤致敏替代方法LuSens的建立与应用

建立皮肤致敏性体外检测方法 LuSens试验，同时评估该方法对我国化妆品原料致敏反应应用的可行性。参考OECD TG442D(Test Guideline No. 442D)标准指南建立方法，确定试验可转移性。对13种化妆品原料组分进行检测，其中10种受试物结果与小鼠局部淋巴结试验（local lymph node assay,LLNA）方法的结果一致，与LLNA相比总体准确性为83%(10/12);11种受试物结果与人体数据一致，与人体数据相比总体准确性为100%(11/11)。成功建立了LuSens检测方法并用于部分化妆品原料的致敏性检测，可较好地筛选皮肤化学致敏原。     

应用DPRA替代方法评价3种香豆素类化合物的皮肤致敏性

应用直接多肽反应试验（DPRA）方法,对化妆品植物提取物原料中存在的蛇床子素、滨蒿内酯、东莨菪内酯3种未知致敏性的香豆素类化合物进行评价。3种香豆素类化合物与半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽模拟的皮肤蛋白共同孵育,使用高效液相色谱法检测3种化合物的多肽消耗率。在标准色谱条件下,蛇床子素和滨蒿内酯与两种多肽的反应体系峰型均正常,东莨菪内酯与赖氨酸反应体系峰型异常,以体积分数0.1%的甲酸水-乙腈流动相体系对标准流动相体系进行优化后检测。结果表明：蛇床子素与半胱氨酸反应体系在反应24 h前产生沉淀,致敏性结果为不确定;滨蒿内酯多肽消耗率均值为6.95%,判定致敏性为阳性,反应等级为弱反应;东莨菪内酯的半胱氨酸多肽消耗率为75.82%,优化色谱条件后的赖氨酸多肽消耗率为80.46%,判定致敏性为阳性,反应等级为中度反应。阳性和阴性对照化合物的结果均与小鼠淋巴结试验（LLNA）致敏性结果一致,实验结果可为3种香豆素类化合物的致敏性提供参考和依据。     

组合应用替代方法评价5种化妆品中常用防腐剂的皮肤致敏性

采用基于不良反应结局路径（AOP）开发的体外致敏性检测方法对5种常用防腐剂进行皮肤致敏性评估。根据整合测试和评估方法（IATA）的3选2原则，使用直接多肽反应试验（DPRA）和人细胞系活化试验（h-CLAT）分别对化妆品中常用的防腐剂苯氧乙醇、4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸丙酯、咪唑烷基脲和DMDM乙内酰脲进行检测。其中，直接多肽反应试验和人细胞系活化试验参照OECD 442C/442E指南的内容进行。实验结果显示，苯氧乙醇、4-羟基苯甲酸甲酯在DPRA和h-CLAT中均为阴性；咪唑烷基脲和DMDM乙内酰脲在2个试验中均表现出阳性结果；而4-羟基苯甲酸丙酯在DPRA中为阴性，h-CLAT中为阳性。该研究结果表明，甲醛释放体类防腐剂咪唑烷基脲和DMDM乙内酰脲是皮肤致敏物，而苯氧乙醇和4-羟基苯甲酸甲酯不是皮肤致敏物，基于文献调研结合更多的实验数据判定4-羟基苯甲酸丙酯为非致敏物。DPRA和h-CLAT的组合测试弥补了单一方法检测的局限性，适用于化妆品原料皮肤致敏性的初筛。     

化妆品原料的过敏性体外方法——氨基酸衍生化反应法（ADRA）方法转化与验证

在皮肤致敏不良结果通路（AOP）的第一个关键事件中化学反应为亲电物质与皮肤蛋白中的亲核中心共价结合，即皮肤与物质接触后，可能与皮肤上的蛋白结合形成抗原，导致不良反应。采用半胱氨酸和赖氨酸衍生物替代皮肤组织，模拟皮肤蛋白与化合物结合，通过计算半胱氨酸和赖氨酸衍生物反应后耗竭值（百分比）将物质分类，以此区分皮肤敏化剂和非敏化剂，此种方法称之为氨基酸衍生化反应法（ADRA）。本实验选择10种致敏性已知的物质，探究ADRA方法用于化合物致敏性评价的准确度，并在10种物质中随机选取几种物质采用国内已转化验证过的方法直接反应多肽法（DPRA）对结果进行验证。结果表明，10种物质致敏性判定结果符合样品自身致敏性，认定ADRA致敏性判定准确度较好，可作为皮肤致敏AOP的第一个关键事件替代实验方法。     

《日用化学品安全评价技术创新—替代方法》专题二 基于有害结局通路原理的皮肤致敏测试替代方法进展

过敏性接触性皮炎是皮肤局部接触外源化学品引起的免疫性皮肤反应,传统的皮肤致敏试验采用豚鼠进行,在3R原则和现代科技发展的推动下,多项动物试验的优化方法和替代方法被开发并通过验证认可,如LLNA、DPRA、KeratinoSens~(TM)和h-CLAT等。替代方法的开发适应了日益增加的化学品和化妆品的致敏筛查需求。目前基于有害结局通路概念开发更符合皮肤生物学机制的替代方法,应用整合测试策略在考虑证据权重和兼顾成本效益的前提下,将适用范围不同的体外方法进行组合是现阶段皮肤致敏替代方法研发的重要方向。     

基于荧光定量的人细胞系激发试验评价皮肤致敏性的研究

建立基于荧光定量(QPCR)的人细胞系激发试验(h-CLAT),探讨其在化学物和化妆品原料皮肤致敏性评价中的适用性。体外培养人急性单核细胞白血病细胞株THP-1,选用8种已知皮肤致敏特性的参照物处理THP-1细胞,通过QPCR检测CD86和CD54共刺激分子的m RNA水平,判定受试物是否具有潜在皮肤致敏性。同时对正在开发的两个化妆品新原料以及致敏物加标的一个植物提取物原料进行了预测。结果显示,当判断标准设置为当THP-1细胞存活率高于50%,MIF CD86大于等于120%和/或MIF CD54大于等于150%,h-CLAT能准确区分致敏物和非致敏物。此外,对致敏物加标的植物提取物原料也能提示其致敏风险。     

氨基酸衍生物结合试验在化妆品检测中的应用

以OECD指南为基础，在实验室建立氨基酸衍生物结合试验（ADRA）方法并进行实验室内验证，同时评估该方法对测试化妆品配方致敏反应的可能性。依据OECD 442C指南，将受试物（包括化学品和化妆水配方）分别与半胱氨酸衍生物和赖氨酸衍生物以50∶1的比例避光孵育24 h，采用高效液相色谱法分析两种氨基酸衍生物的消耗，计算氨基酸衍生物消耗率并依据ADRA预测模型对受试物致敏性进行判定。同样条件下使用商业化ADRA试剂盒按照操作规程检测相同受试物的致敏性。由试验结果可知，实验室建立的ADRA方法可以准确区分13种化学品的致敏性，检测结果与OECD442C指南及文献中小鼠淋巴结试验（LLNA）结果一致，也与商业化试剂盒检测结果一致；ADRA对5种化妆水配方检测结果显示4种为致敏物、1种为非致敏物。     

皮肤致敏测试动物替代方法DPRA的建立和应用

皮肤致敏是化妆品原料安全性评估中的一项重要内容。按照ECVAM(European Centre for the Validation of Alternative Methods)的标准,通过对16个标准品进行检测,成功建立了DPRA(Direct Peptide Reaction Assay,直接肽链反应分析)实验方法。其检测结果的敏感性,特异性,准确性,S/NS的判定以及4 Class分别为81.82%,100%,77.8%,100%和94.7%。目前该方法已成功运用在实际工作中,并检测出多款具有引起皮肤致敏潜在能力的化妆品原料。     

化妆品用原料对羟基苯乙酮的局部毒性研究

利用体外方法对对羟基苯乙酮的局部安全性进行研究,为化妆品的安全性评估提供依据。所使用的模型或方法包括三维皮肤模型、三维角膜模型、HET-CAM鸡胚绒毛尿囊膜实验、DPRA直接多肽反应实验、h-CLAT人细胞系活化试验等。结果显示:质量分数5%对羟基苯乙酮不会对皮肤模型中的组织活力造成显著影响;三维眼角膜模型实验表明,对羟基苯乙酮的IC50 (50%细胞存活时的受试物浓度)为3.1%;当质量分数达到2%时,该物质的鸡胚实验刺激评分为0;DPRA和h-CLAT结果均为阴性。综合上述,对羟基苯乙酮作为化妆品原料在一定使用浓度下,引起皮肤刺激、眼刺激以及皮肤致敏的风险很低。     

兔角膜上皮细胞超短时暴露中性红摄取试验替代化妆品动物眼刺激试验方法的研究

采用体外培养的兔角膜上皮细胞30 s暴露中性红摄取(SIRC-NRU)试验评价了75个化妆品产品的眼刺激性,并与家兔眼刺激试验结果进行比较,以考察其替代整体动物试验评价化妆品眼刺激性的可行性,初步建立了本实验室用于化妆品产品眼刺激性的评价标准。家兔眼刺激试验结果表明,75个样品中,有10个样品具有轻、微眼刺激性,其余样品均无眼刺激性。SIRC-NRU试验结果表明,LC503%的共65个,其余10个受试样品的LC503%,样品的动物试验眼损伤积分与LC50的相关系数rs=-0.570 9,P0.001;按照LC50≥3%为眼刺激阴性的分级标准,有65个样品被分级为无眼刺激性,10个样品被分级为眼刺激性阳性。如以动物试验结果为标准,SIRC-NRU试验对样品眼刺激性分级的灵敏度为83.3%,特异度为97.0%,准确度为94.7%,假阳性率为3.1%,假阴性率为20.0%。以上结论表明SIRC-NRU可以作为化妆品动物眼刺激试验的替代方法,对眼刺激性的分级标准可以采用LC503%为眼刺激性阳性,LC50≥3%为无眼刺激性。     

鸡胚绒毛尿囊膜试验用于化妆品的体外眼刺激性评价

采用鸡胚绒毛尿囊膜(HET-CAM)试验评价了66种不同品类化妆品筛选配方或终配方产品的眼刺激性,并与家兔眼刺激试验结果比较,考察HET-CAM试验的可靠性,并建立本实验室该方法的化妆品产品眼刺激性评价标准。家兔眼刺激试验结果表明,66个样品中有6个样品具有微刺激性,4个样品为轻刺激性,其余样品均无眼刺激性。按照国家质量监督检验检疫总局的行业标准分级,HET-CAM法共有38个样品为眼刺激阳性,假阳性率50.0%,假阴性率为0,灵敏度为100%,特异度为66.7%,如果采用≤4分为眼刺激阴性,>4分为眼刺激阳性的评价标准,则66个样品中有29个样品为眼刺激阳性,37个样品为眼刺激阴性,灵敏度为100%,特异度提高至74.7%,假阴性率为0,假阳性率降低至33.9%。结果显示,HET-CAM试验用于化妆品产品的体外眼刺激性评价时,可采用刺激积分≤4分为无眼刺激,>4分为眼刺激性阳性的判断标准。     

基于超高效液相色谱的改良直接肽反应试验预测化学物皮肤致敏性

建立基于超高效液相色谱改良直接肽反应试验预测化学物致敏性并提高检测效率和通量。选择8种已知皮肤致敏性化合物与半胱氨酸多肽或赖氨酸多肽反应24 h,通过基于超高效液相色谱或高效液相色谱的检测系统计算得到多肽消耗率预测受试物皮肤致敏性。结果显示,基于超高效液相色谱的改良直接多肽反应试验能正确区分8种化学物为皮肤致敏物或非致敏物,且节省检测时间,提高检测通量,同时色谱峰分离度更高。     

皮肤致敏测试整合策略的现状与展望

近年来,化妆品接触性皮炎、化妆品痤疮等化妆品皮肤病发病率呈明显上升趋势,日益严峻的化妆品的安全问题引起了社会的广泛关注。因此,国家陆续出台了一系列法律法规进一步规范化妆品的安全性问题,企业也必须对化妆品原料及成品进行充分的安全性评价和风险物质评估。皮肤致敏性检测是化妆品安全评价的毒理学终点之一。由于欧盟已全面禁止化妆品成分动物实验和禁止销售经过动物实验的化妆品原料及成品,因此,传统的动物实验尽管能满足皮肤致敏性测试要求,但不符合3R原则,所以替代实验逐渐取代动物实验成为化妆品安全性评价的重要工具。目前,通过OECD认证的单一致敏替代实验主要包括直接肽链反应检测实验、KeratinoSens~(TM)实验、人细胞系活化实验等等。但单一的致敏替代实验通常不足以准确判断化合物的致敏性。因此,常将不同的单一实验结果根据AOP通路组合成整合策略,综合判定化合物的皮肤致敏性,从而提高预测准确性。目前,现有的整合策略主要由巴斯夫、欧莱雅、资生堂等几大日化企业自主开发,包括3选2原则、stacking-meta模型、ANN-EC3模型等。由于中国对动物替代实验方法引入较晚,国内日化企业及机构尚未开发自有的整合模型,但我们正在努力开发新型的皮肤致敏替代技术,例如在基因实时表达报告细胞构建、新QSAR计算机系统开发及THP-1/KC共培养系统构建等方向均已取得了较好成果。文章就日化相关企业目前使用的皮肤致敏测试的整合策略方法进行概括与阐述,并总结了中国自主开发的皮肤致敏替代方法的发展现状。     

火焰原子吸收分光光度法测定化妆品中总镉的含量方法验证

按照《《化妆品安全技术规范》(2015年版)第四章理化检验方法 1.5镉》方法测定化妆品中重金属镉的残留量。通过对方法的检出限、精密度和准确度的研究与分析,证明实验室使用该方法的可靠性和准确性。结果表明,方法的检出限为0.14mg/kg,精密度为0.93%,准确度为98.0%。证明该方法的灵敏度高,重现性好,结果精确,能满足实验室的检测要求。     

防晒剂原料甲氧基肉桂酸乙基己酯在三种动物替代实验中的研究

选用化妆品防晒剂原料甲氧基肉桂酸乙基己酯,分别进行体外兔角膜上皮细胞短时暴露实验,体外3T3中性红摄取光毒性试验与皮肤变态反应：局部淋巴结试验(DA法,LLNA:DA)等动物替代实验。防晒剂原料在三个实验中结果均为阴性。动物替代实验相对于传统动物实验更高效,数据更客观并符合动物伦理要求,加快替代实验的研究、验证和认可工作,将有助于加速我国的化妆品检验标准与国际接轨。     

气相色谱法同时检测化妆品中限用苯酚类防腐剂

建立了同时测定化妆品中7种限用苯酚类防腐剂气相色谱方法。将化妆品中的目标化合物用乙醇振荡提取,在-10℃下,以10 000 r/min离心5 min后进样,经毛细管色谱柱ZB-1(30 m×0.32 mm×0.25μm)分离,氢火焰离子化检测器测定,外标法定量,并采用气质联用法确证。方法学研究结果表明,7种目标化合物在质量浓度2~400μg/m L范围内具有良好线性关系,相关系数为r≥0.9990,定量限为10~30 mg/kg;回收率为78.5%~99.4%,相对标准偏差为1.42%~4.86%。该方法简便、快捷,灵敏度和准确度均较高,可用于化妆品中7种限用苯酚类防腐剂的同时测定。     

UPLC-MS/MS法测定化妆品常用植物提取物中16种香豆素类化合物

建立了同时测定常用化妆品植物提取物原料中16种香豆素类化合物的UPLC-MS/MS法，为评估植物提取物作为化妆品原料的安全性和规范植物提取物在化妆品中的应用提供理论依据。采用液质联用法，应用Waters ACQUITY HPLC BEH C18柱，以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相，梯度洗脱分离，质谱采用正离子模式，多反应监测，流速为0.3 mL/min。16种香豆素类化合物在各自质量浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数均大于0.995。在低、中、高3个加标水平的平均回收率为85.7%～108.6%，相对标准偏差为1.5%～5.8%,16种香豆素类化合物检出限为0.3～28.0μg/kg，定量限为1.0～93.0μg/kg，收集的14批植物提取物中，4批检出香豆素类化合物。该方法准确、分析速度快、操作简便、灵敏度高，能满足化妆品植物提取物原料中16种香豆素类化合物的定性筛查和定量检测要求，为探究植物提取物致敏风险物质基础提供一种思路，建议关注化妆品植物提取物原料带入致敏成分的安全风险情况，建立化妆品植物提取物原料质量控制和使用规范。