绿僵菌Ma83固态发酵几丁质酶和部分酶学性质的初步研究

研究了金龟子绿僵菌MetarhiziumanisopliaeMa83菌株产几丁质酶的固态发酵条件和粗酶液的酶学性质。研究结果显示 ,当以麸皮∶蚕蛹粉为 3∶1作为培养基 ,最适氮源为1%NaNO3,起始pH为 6 5 ,发酵温度为 31℃ ,接种量为 2mL液态种子时酶活力最高。此外 ,添加稻壳对Ma83产几丁质酶有促进作用。该菌株在生长 2d时 ,酶活力达 33 9U /g干培养基。酶的最适反应温度为 5 0℃ ,最适反应 pH为 6 0 ;不同温度保温 1h后 ,酶的半失活温度为 42℃。不同 pH值的缓冲溶液中 (2 5℃ )放置 1h后 ,酶在pH 5 0～ 6 0条件下稳定性最高     

酸橙内生菌Bacillus thuringiensis Bt028几丁质酶的分离纯化及其酶学性质

为揭示酸橙内生菌Bacillus thuringiensis Bt028几丁质酶的基本酶学性质,采用离心、硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶G-100层析及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法对菌株Bt028发酵液中的几丁质酶进行分离纯化鉴定,并考察该几丁质酶的最适温度、最适pH、催化动力学参数等性质。结果表明,Bt028菌株发酵液经离心、硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶G-100层析分离纯化后获得电泳纯几丁质酶比活力为681.78 U/mg,纯化倍数为3.21,回收率15.52%。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,几丁质酶的分子质量为65 kDa。酶学性质研究结果表明,该酶的最适反应温度为60 ℃,最适反应pH为6.5,在温度低于60 ℃、pH5.5~7.5时有较好的稳定性;Mg2+、Ca2+、Hg2+、Co2+对该酶活力有抑制作用,而Cu2+和Fe3+有一定的促进作用;低浓度的甲醇、乙醇、正丙醇和二甲亚砜使酶的活性增加,但当浓度继续增大,反而会抑制酶的活性;丙酮对几丁质酶有激活作用,而甲醛对几丁质酶有抑制作用。在最适催化条件下,几丁质酶催化反应的米氏常数Km、最大反应速率Vmax、酶的转换数Kcat分别为29.533 mg/mL、108.696 μmoL/(L·min)和0.527/min。研究结果可为该酶的实际应用提供必要的工艺参数。     

几丁质脱乙酰酶菌株的筛选鉴定及酶学性质

利用平板变色圈法从土壤中筛选出一株产几丁质脱乙酰酶活力较高的菌株,命名为F2-7-3。为分离筛选出几丁质脱乙酰酶高产菌株、生物制备几丁质脱乙酰酶提供来源,并为进一步提高该菌株产酶能力及酶的活性提供研究基础,通过形态学观察、生理生化实验、16SrDNA测序分析等方法对该菌株进行了鉴定,并对其发酵产生的脱乙酰酶的酶学性质进行了研究。经鉴定该菌株为红球菌属。酶学性质研究表明,该酶反应的最适温度为50℃,最适pH为7.0,Mn2+、Ca2+及K+在低浓度下对酶促反应有激活作用。分析结果表明该菌产酶能力较强,具有良好的开发价值。     

一株产几丁质脱乙酰酶海洋细菌的Rhodococcus hoagii筛选、鉴定及酶学性质

从连云港高公岛海域采集的海泥中使用平板变色圈法初筛和摇瓶发酵复筛后,获得一株产几丁质脱乙酰酶的菌株MCDAⅡ-2。综合形态学特征以及16SrDNA序列分析最终将菌株MCDAⅡ-2鉴定为Rhodococcus hoagii。进而研究其酶学性质,得该几丁质脱乙酰酶最适催化温度为35℃,最适pH为8.0。Na^+、Mg^2+、Li+、Sr^2+对酶促反应起到促进作用,Ca^2+、Ba^2+、Co^2+、Cd^2+、Fe^2+及EDTA对酶促反应起到了抑制作用,而K^+对酶促反应影响较小。酶在25℃~35℃时较稳定,在中性和弱碱性条件下稳定性较好。本次研究的结果将为几丁质脱乙酰酶的工业化应用奠定基础。     

纤维素酶高产担子菌株的筛选鉴定及酶学性质初探

从河北省棉田土壤样中分离出一株纤维素酶高产菌株,经中科院微生物所鉴定,初步确定为一株担子菌(a basidiomycetous specie),将其命名为担子菌LKY01.对该菌株酶学性质进行了初步探索.研究表明,本酶反应最适pH值为5.0左右;最适反应温度约60℃;Co2+、Mn2+对本酶酶活有明显的抑制作用,Cu2+、Fe2+、Ca2+、Na+、K+、Sr2+、Mg2+对本酶有一定的促进作用;在50℃下本酶有较好的稳定性,其酸碱稳定范围在pH 4.0～8.0.     

海洋产几丁质酶厦门加西利亚单胞菌Chi34的筛选、鉴定及酶学性质分析

目的：海洋是自然界中含几丁质最多的生态系统,孵育了大量可降解利用几丁质的微生物,因此利用海洋微生物几丁质酶降解几丁质,是获得高附加值几丁寡糖的重要方法。本试验以连云港海域海泥为样品,以期筛选获得稳定的产几丁质酶菌株。方法：利用平板筛选法和摇瓶发酵复筛法筛选获得产几丁质酶菌株Chi34,利用形态学分析和16S r DNA序列分析对菌株进行鉴定,同时还研究了温度、pH、金属离子、EDTA及SDS等因素对Chi34几丁质酶的影响,最后通过TLC实验分析了Chi34几丁质酶降解几丁质胶体的产物。结果：菌株Chi34鉴定为厦门加西利亚单胞菌(Gallaecimonas xiamenensis),其几丁质酶酶活力为0.631 U/m L,最适反应温度为35℃,最适反应p H为6.0,Na₊、Ca₂₊、Mn₂₊、K₊对Chi34几丁质酶具有显著的激活作用,Cu₂₊、Fe₃₊、Ba₂₊、Zn₂₊、Cd₂₊、...     

黏质沙雷氏菌胞外几丁质酶的纯化及特性

黏质沙雷氏菌几丁质酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE-琼脂糖凝胶阴离子交换层析和苯基-琼脂糖凝胶疏水层析,得到电泳纯的几丁质酶和几丁质结合蛋白CBP21。该几丁质酶和CBP21分子质量分别约为58 ku和21 ku,CBP21对该几丁质酶水解几丁质增效明显。几丁质酶反应最适温度为50℃,最适pH约为6.5～7.0。该酶在55℃以下、pH 4.5～8.0范围内稳定。酶的Km值为0.22 mg/mL,Vm为1.26μmol/(min.mg)。金属离子K+、Sn2+、Mn2+对酶有一定激活作用,而Pb2+、Hg2+和Cu2+则强烈抑制其活性。该几丁质酶的糖基含量约为3.3%。EDTA和2-ME可分别提高酶活力65%和105%。H2O2强烈抑制酶活力,提示其活性中心可能存在硫氢基。     

单胞菌产几丁质酶的酶学性质研究

对从海水中分离得到的嗜水气单胞菌所产的几丁质酶的酶学性质进行研究.其最适pH为7.0左右,最适反应温度为45 ℃左右.在40 ℃以下有良好的热稳定性,12 h仍有50%残余酶活.Mg2 对酶有激活作用,Cu2 和Al3 对酶有明显的抑制作用.该酶对底物的亲和力很大,水解几丁质的Km值为29.15 g/L.     

短短芽孢杆菌几丁质酶的分离纯化及酶学性质

探讨来源于短短芽孢杆菌FM4B的几丁质酶（chitinase）分离纯化过程及其性质。菌株FM4B摇瓶发酵液经过离心、乙醇分级沉淀及葡聚糖凝胶G-100层析纯化,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳确定其分子质量。结果获得几丁质酶纯品,酶的纯化倍数为7.19,酶活回收率为30.6%,分子质量为66 kD;酶活力在pH 5.0～9.0和80 ℃以下稳定,最适pH值为6.0,最适温度为50 ℃;Cu2+、Hg2+、Pb2+、Co2+以及Zn2+对该酶有强烈的抑制作用,Mg2+ 和Ca2+对该酶的活力具有一定的促进作用;该几丁质酶对多种霉菌有显著的抑菌效果。菌株FM4B分泌的几丁质酶稳定性好,且对多种霉菌抑制效果明显,具有较高的潜在利用价值。     

海洋来源产低温几丁质酶菌株的诱变选育及酶学性质研究

为研究菌株Photobacterium sp. LG-1理化性质,提高其产酶活性。利用BIOLOG对其进行生理生化实验,通过紫外诱变、化学诱变及复合诱变进行育种,并对其进行酶学性质及抑菌性研究。结果表明,该菌株复合诱变后酶活达2.690 U/mL,酶活提高率为139.78%;最适反应温度为35 ℃,0 ℃仍具有催化活性;最适反应pH为8.0,在偏碱性环境中有较好的稳定性;Ca2+、K+、Mg2+、Cu2+、Na+对几丁质酶活性有促进作用。LG-1对根霉、黑曲霉、毛霉及玉米腐烂病有抑制活性。     

醋酸菌中乙醛脱氢酶的分离纯化及酶学性质

以实验室筛选得到的醋酸菌(Acetobacter pomorum)为实验菌株发酵产酶,通过细胞破壁,采用(NH₄)₂SO₄沉淀、透析、DEAE-Sepharose 离子交换层析及 Superdex G-75凝胶过滤层析分离纯化得到乙醛脱氢酶的酶液,并考察其酶学性质。该酶分子质量为221.60 kDa,单个亚基分子质量约为54.41 kDa,为四聚体结构;纯酶液比活力20.25 U/mg,纯化倍数为10.16倍,乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)的回收率为6.53%。酶学性质研究表明,ALDH促进乙醛分解的最适温度为50 ℃,40~50 ℃相对酶活力稳定性好;该酶的最适pH为7.0,当pH在5.5~7.5内酶活力表现稳定;金属离子对酶活性的影响实验表明,Na+、K+、Zn2+、Ba2+对该酶酶有不同程度抑制作用,而Mg2+、Ca2+、Al3+、Li+、Cu2+具有促进作用;ALDH的最适底物为乙醛,相对偏好直链醛类。ALDH活性较大,为后期表达和深入研究其生物学功能提供理论和数据支持。     

鸭卵清溶菌酶的分离纯化及性质

通过硫酸铵的分级沉淀、CM-Sepharose阳离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析等步骤,从鸭卵清中获得电泳纯的溶菌酶,该酶的比活力达到33687.26U/mg,纯化倍数为109.44,回收率为28.00%。测得该酶分子质量约为14.82kD,对溶壁微球菌的最适反应温度为50℃,最适pH值为7,且在50℃以下及pH5～9有较好的稳定性,同时在最适条件下测得其Km值为0.0864mg/mL。Fe2+、Mg2+、Mn2+等金属离子对该酶有较强的抑制作用,而Zn2+、Cu2+、Co2+对该酶有一定的激活作用。     

木薯块根中β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

研究了木薯块根中β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质。以缓冲液从木薯块根中获得粗提酶液,粗酶酶活力为9.37 U/g木薯干重;再分别通过丙酮沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析进行纯化,β-葡萄糖苷酶酶活力为1.14 U/g木薯干重,经纯化β-葡萄糖苷酶纯度提高了14.62倍,总活力回收率为12.14%,电泳测得其分子量约70 kDa。该酶米氏常数K_m为3.60 mmol/L,V_max为12.36μmol/(min·mg protein);其最适pH为7.0,pH在6.0～8.0之间有较好的稳定性;在40℃以内有良好稳定性,在4℃存放30 d酶活力剩余81.78%。Mn²⁺和K⁺对酶有一定的促进作用,Al³⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Na⁺、尿素和SDS对酶没有显著影响(P>0.05),而Fe³⁺、F...     

杂优-2平菇漆酶的分离纯化及酶学性质

将杂优-2平菇菌丝进行液体培养,发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE（diethylaminoethyl）-Sepharose fastflow层析和Superdex-200 prep grade层析等方法纯化,获得了电泳纯的杂优-2平菇漆酶,并对纯化的漆酶进行了部分酶学性质研究。结果显示,杂优-2平菇漆酶比活力为115 U/mg,分子质量约为244.0 kD,亚基分子质量约为85.6 kD。最适反应pH值和最适反应温度分别为5.0和55 ℃,在pH 6.0～8.0及40～55 ℃范围内稳定性较好;最适条件下,以2,2’-联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）为底物的Km值为2.1 mmol/L,最大反应速率（vmax）为0.117 μmol/（min·L）。Fe2＋、抗坏血酸对该酶活性具有完全抑制作用,乙二胺四乙酸、Ag＋、Mg2＋、Li＋对该酶活性影响较小;草酸、甲醇、正丁醇、K＋、Ca2＋、Ba2＋、Zn2＋、Cd2＋、Pb2＋、Mn2＋、Co2＋对该酶活性有不同程度的抑制作用;Cu2＋激活作用不明显;尿素、乙醇、异丙醇对该酶活性具有激活作用。     

黑曲霉酸性果胶裂解酶的高效表达及其在果汁澄清中的应用

利用黑曲霉自身强启动子（葡萄糖淀粉酶启动子,PglaA）实现了酸性果胶裂解酶PelD在黑曲霉中的过量表达,重组酸性果胶裂解酶经镍柱亲和层析纯化后进行Western blot鉴定及酶学性质研究。重组酸性果胶裂解酶在摇瓶发酵条件下最高酶活力达到8?822.6?U/mL;经一步纯化后,该重组酶的比活力为8?522.7?U/mg,回收率为79.4%;该重组酶的最适反应pH值为5.0,在pH?3.0～6.5范围内40?℃保温2?h仍能保持50%以上的相对酶活力,在酸性pH值下稳定性良好;最适反应温度为50?℃,该重组酶在30～50?℃的范围内非常稳定;在1?mmol/L浓度下,Ca2＋、Mg2＋、Cu2＋、Zn2＋、Ni2＋、Mn2＋、Ba2＋对该重组酶具有激活作用,其中Zn2＋、Ni2＋、Ba2＋激活作用较为显著,而十二烷基硫酸钠表现为抑制作用;底物特异性分析表明该酶能够特异性地降解高度甲酯化果胶,其对柑橘果胶（酯化度≥85%）酶活力高达31?248.0?U/mL;此外,重组酶对橙汁、苹果汁和葡萄汁具有良好的澄清效果,其中橙汁的透光度提高了16.9?倍,苹果汁的透光度提高了10.5?倍,葡萄汁的透光度提高了4.7?倍。     

海栖热袍菌α-葡萄糖苷酶基因aglA的克隆、表达及酶学性质

主要研究了在大肠杆菌中克隆和表达海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的一个α-葡萄糖苷酶(TM1834).通过PCR方法克隆编码T.maritima的一个α-葡萄糖苷酶基因aglA,构建重组质粒pHsh-AglA,电击转化Escherichia coli JM109,通过热激诱导高效表达.SDS-PAGE检测出蛋白相对分子质量约55 000,经热处理,阴离子交换层析和疏水层析纯化后的α-葡萄糖苷酶最适反应温度为90℃,最适反应pH为7.5,在pH 6.5～8.5,温度65～100℃之间酶活仍达到50％以上.在辅助因子NAD+,Mn2+和还原剂DTT的存在条件下达到最高酶活.     

产黄青霉抗真菌几丁质酶的纯化及特性分析

为实现抗真菌性能的耐热新型几丁质酶在食品防腐及生物防治方面的应用，从产黄青霉Xch23中分离纯化几丁质酶（Chi-Pc76）并研究其应用特性。通过硫酸铵沉淀、DEAE-Cellulose A52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析纯化得到均一的Chi-Pc76。最终得到Chi-Pc76纯化倍数17.1 倍，回收率21.6%，比活力为584.8 U/mg。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得Chi-Pc76分子质量61 kDa。纯化后的Chi-Pc76最佳反应条件为pH 6.0、温度55 ℃。Chi-Pc76在宽泛的pH 4.0～10.0之间稳定性强，其显著的热稳定性可达到70 ℃。Chi-Pc76对底物胶体几丁质具有高的底物特异性，对乙二醇几丁质、α-几丁质、β-几丁质有中等活性，而对其他受试底物无活性或痕量活性。以胶体几丁质为底物Km和Vmax值分别为0.25 mg/mL和20 μmol/（min·mg）。金属离子Ca2＋、Ba2＋、K＋、Na＋对酶有明显激活作用；十二烷基硫酸钠、吐温80、苯甲基磺酰氟和尿素对酶活力基本无影响，但Mn2＋、Co2＋、Fe2＋、Ag＋、Cu2＋、Zn2＋、Pb2＋、Hg2＋和β-巯基乙醇、二硫苏糖醇均对酶活力有抑制作用。Chi-Pc76对黑曲霉、黄曲霉、尖孢镰刀菌和橘青霉均有显著的抗真菌活性，对比文献为产黄青霉抗真菌几丁质酶。鉴于Chi-Pc76纯化简便、热稳定性好、宽广的pH值稳定性、高效降解几丁质和抗真菌等特点，产黄青霉Xch23几丁质酶在几丁质废料综合利用、生物转化药理活性产品、食品保鲜以及植物病原性真菌和昆虫幼虫生物防治等方面具有潜在价值。     

构巢曲霉产植酸酶的酶学特性分析

从构巢曲霉AnP-16菌株发酵液中纯化单一组分的耐热耐酸植酸酶,并对酶学特性进行分析,为其在食品工业中的应用提供理论依据。通过硫酸铵盐析、离子交换层析和疏水层析纯化植酸酶,SDS-PAGE电泳测定其分子量。结果表明,从该菌株发酵液中纯化到了单一组分的植酸酶,纯化倍数60.8倍、回收率41.6%,酶分子量约52 kDa。植酸酶最适作用温度和pH分别为55 ℃和pH4.0,在pH3.0~6.0范围酶活性较高,pH2.0~7.0下孵育3 h,仍能保持80%以上活性。植酸酶耐热性好,70 ℃孵育1 h仍能保持81%活性。Hg2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+和Zn2+ 5 mmol/L浓度下对酶活性有明显抑制作用,但Ca2+和Mg2+在1和5 mmol/L浓度时均增强酶活性;有机溶剂甲醇和乙醇在2%浓度有激活作用;SDS抑制酶活性,但其它表面活性剂(Triton X-100和Tween 80)和有机溶剂(丙酮和异戊醇)对酶活性无明显影响。植酸酶有宽泛的底物特异性,但对植酸钠的催化活性最强,其K_m值为0.576 mmol/L。基于植酸酶耐酸耐热及宽广的底物催化活性,其有望应用于粮油食品加工领域,提高食品的营养价值。     

红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

以红佳酿酿酒酵母为出发菌株,通过离子交换法分离纯化β-葡萄糖苷酶,测定酶活力和蛋白质含量,并研究温度、pH值稳定性和金属离子、葡萄糖、酒精度对酶活力的影响。结果表明:粗酶液经过离子交换层析后,纯化倍数为19.41,得率为38.67%;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)电泳检测为1条谱带,达到电泳纯,分子质量约为45 kD;β-葡萄糖苷酶热稳定性较差,在20~40℃较稳定,在pH 5.0~10.0较稳定;Al3+、Cu2+对酶活力有抑制作用,K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Na+对酶活力的影响不明显;葡萄糖和酒精对酶活力无明显抑制作用。     

长双歧杆菌α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质

对长双歧杆菌KLDS2.0509所分泌的α-半乳糖苷酶进行分离纯化,并对其酶学性质进行研究。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶的分子质量约为45 kD;酶学性质研究表明,该酶最适作用pH值为5.0,最适温度42 ℃;大多数金属离子对酶的活性无显著影响,Fe2+、Mn2+、Ag+和Cu2+能够对其产生抑制作用,而Hg2+完全抑制酶活性;该酶可降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。