固定化脂肪酶手性拆分2-芳基丙酸类药物研究进展

2-芳基丙酸(2-APA)类药物是一类重要的非甾体抗炎药,临床研究证实2-APA类药物对映体之间在药效上存在较大差异,因此光学纯2-APA类药物疗效更好、安全性更高。固定化脂肪酶在手性制备2-APA类化合物上具有绿色环保、立体选择性强、催化活性高等优势,展现出极大的市场应用潜力。本文分别从布洛芬、萘普生及其衍生物的手性制备方面综述了国内外研究进展,并指明该领域中亟待解决的关键问题,以期为后续固定化脂肪酶应用于手性拆分2-APA类化合物提供参考。     

脂肪酶的固定化及其手性拆分的研究进展

将脂肪酶固定化可提高酶的选择性、稳定性等,已广泛应用于手性拆分等研究。常用的高分子固定化载体有聚丙烯酸多孔树脂及带功能基团的共聚物等。从脂肪酶结构的角度介绍其手性拆分机理,并具体讨论了一些商品化固定化脂肪酶在手性拆分中的应用及固定化载体材料对手性拆分的影响。     

固定化沙雷氏菌脂肪酶拆分(R,S)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯

利用海藻酸钙-戊二醛交联法对本实验室筛选到的一株能选择性拆分(R,S)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯〔(R,S)-HPBE〕的沙雷氏菌脂肪酶进行固定化,并对固定化脂肪酶的酶活和拆分条件进行了研究。结果表明,最适反应温度为50℃,pH=7.0,底物浓度40 mmol/L,ρ(酶液)=200 g/L,在该条件下,反应10 h后,(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯〔(R)-HPBE〕产率达93.4%,光学纯度(e.e.)为96.2%。连续反应12批次,固定化脂肪酶仍可使(R)-HPBE产率维持在80%以上。     

固定化细胞酶法拆分DL-精氨酸

以DL-精氨酸为原料,用固定化细胞酶法拆分DL-精氨酸,并对拆分条件进行了研究。结果表明:最适反应温度55℃,最适pH=6.0,c(DL-精氨酸)=0.3 mol/L,ρ(菌体)=30 g/L,拆分反应10 h,拆分率达98%以上。连续反应10批次,固定化细胞仍保留最高酶活力的75%。产物经分离纯化,D-精氨酸收率达84.0%,[α]2D5=-27.4°〔ρ(D-精氨酸)=20 g/L,5 mol/L盐酸〕。     

用壳聚糖修饰的大孔SiO_2材料固定化脂肪酶拆分萘普生甲酯

以壳聚糖(Chitosan,CS)修饰的大孔SiO_2材料为载体,通过吸附法固定柱状假丝酵母菌脂肪酶(Candida rugosa lipase,CRL)获得了CRL/CS-SiO_2固定化脂肪酶。并以催化拆分萘普生甲酯水解反应为对象,研究大孔SiO_2载体性能以及CRL固定量对反应的影响。结果表明,该CRL/CS-SiO_2固定化酶在结构上仍然保持载体Si O_2材料的微米级孔道,且CRL以纳米薄层的形式较为均匀地涂覆在孔道表面上。该固定化酶催化生成(S)-萘普生的转化率和选择性都远高于游离酶,其产物转化率随着CRL酶固定量的增加而增大,当CRL负载量为53.2 mg/g,反应120 h时,(S)-萘普生的转化率可达到44.6%,对映体过剩值eep达到100%,对映体选择性远大于200。     

大孔载体固定化脂肪酶

用自制大孔载体固定化脂肪酶,对固定化条件进行了优化,比较了固定化酶与游离酶的酶学参数. 结果表明,酶粉与载体质量比为1:1、固定化温度在20~25℃之间、固定化时间1.5 h的条件下,所得固定化酶的酶活最高. 固定化酶的最适pH为8.5,最适温度为40℃,其热稳定性、操作稳定性都比游离酶高,4℃下保存7 d后,酶活仍剩余94%.     

天然固定化木瓜脂肪酶催化芳香仲醇动力学拆分的研究

将木瓜来源的廉价天然固定化脂肪酶CPL用于手性拆分芳香仲醇,以4-苯基-2-丁醇作为模式底物,考察了反应温度、反应溶剂、酰基供体以及底物摩尔比对CPL拆分能力的影响,结果表明,适宜的反应温度30~45℃,酰基供体为活性乙烯酯,正己烷或环己烷作为反应溶剂,底物/酰基供体摩尔比1∶2,在该条件下底物的转化率接近50%,e.es大于99%,反应的对映体比值E大于200。CPL对其他结构类似的芳香仲醇也具有很好的拆分能力。该研究为手性芳香仲醇的酶催化制备提供了新的催化剂选择。     

糖对溶胶-凝胶法固定化脂肪酶CALB的影响

选择糖类物质作为sol-gel法固定脂肪酶Candida antarctic lipase B,CALB）过程的保护剂,研究了蔗糖、葡萄糖、海藻糖、木糖、麦芽糖、乳糖等糖分子对固定化酶活的影响,结果显示：添加木糖、海藻糖、葡萄糖进行固定化后CALB的活性较高,其中加入木糖的作用最为显著,CALB的活性最高。并借助红外分析、热分析研究了木糖对CALB脂肪酶的作用机理。认为木糖对CALB的保护作用为：木糖分子的羟基同酶的酰胺基形成了氢键,而且木糖分子与酶分子之间还发生了其它相互作用,糖分子能够紧密地包裹在酶分子周围, 使酶分子得到很好的保护,脂肪酶CALB的活性和热稳定性均有所提高。     

一种选择性拆分布洛芬对映体的固定化脂肪酶

为了提高扩展青霉TS414脂肪酶(PEL)对布洛芬的拆分效率,建立了适于非水相中选择性拆分(R,S)-布洛芬的固定化方法. 结果表明,固定化介质的类型、冻干pH和外加水量等因素对固定化PEL酶促拆分(R,S)-布洛芬有较大影响. 在冻干pH为9.0、外加水量为0、以大孔吸附树脂AB-8为固定化载体的体系中,40℃反应30 h后,拆分反应的转化率可达47%,对映体过量值eeP可达98.75%. AB-8固定化后,PEL在有机相反应体系中的分散性得到了明显改善,大幅度提高了酶促拆分反应的效率;大孔吸附树脂AB-8固定化PEL具有较高的操作稳定性,连续10批拆分反应的平均转化率在47%以上,eeP值均稳定在98%以上.     

手性2-辛醇原料市场前景广阔

手性2-辛醇是液晶不可缺少的重要手性原料。也是合成类固醇、维生素E和昆虫性外激素等许多光学活性药物和农药的重要手性中间体，具有广阔的市场，产品的国际售价约6．4万元／kg，现在利用酶工程技术，以化工副产品外消旋2-辛醇为主要原料，在常温常压进行，制备的手性2-辛醇的光学纯度达98%，该技术能源和设备投资少，无环境污染，生产成本低，约4000—5000元/kg。     

非达司他中间体的酶法拆分

(2S)-6-氟-3,4-二氢-4-氧代-2H-1-苯并吡喃-2-羧酸是合成非达司他(一种口服醛糖还原酶抑制剂)关键中间体。该研究使用脂肪酶Novozym 435,对(±)-6-氟-3,4-二氢-4-氧代-2H-1-苯并吡喃-2-羧酸甲酯进行拆分,并对拆分反应条件进行了优化,确定了拆分的最适反应条件:乙腈-水溶液为溶剂,V(水)∶V(乙腈)=1∶4,m(酶)∶m(底物)=1∶10,在pH=7.0,温度40℃,时间为6 h条件下,得到的(2S)-6-氟-3,4-二氢-4-氧代-2H-1-苯并吡喃-2-羧酸的总收率为32.5%,对映体过量值为92.1%,为非达司他的制备提供了一条可行途径。     

高选择性脂肪酶的筛选及其拆分布洛芬

为了实现脂肪酶在有机相中对外消旋布洛芬的高效拆分,筛选得到了一株具有高立体选择性的脂肪酶产生菌-扩展青霉TS414(Penicillium expansum TS414). 实验探讨了水分、温度、有机溶剂、酶浓度、醇结构和醇浓度对酶促拆分反应的影响,确立了酯化反应的最佳反应体系：布洛芬6.46 mmol/L,脂肪酶53.3 mg/mL,正丙醇40 mmol/L,异辛烷15 mL,水0.5%(j),60℃条件下反应50 h. 在此条件下,拆分反应的转化率和对映体选择率分别为42%和429.63. 结果表明,Penicillium expansum TS414脂肪酶是一种较为理想的用于外消旋布洛芬拆分的工具酶,在布洛芬手性拆分方面具有广阔的应用前景.     

用蛋白质工程技术提取和修饰南极假丝酵母脂肪酶B

从南极假丝酵母中提取的脂肪酶B,具有较高的对应异构体选择性,广泛应用在培养基中,作为不对称有机化学的生物催化剂。近年来,一系列组合蛋白质工程研究和扩展了南极假丝酵母脂肪酶的催化和物理特性。这些工程不但生产出了指定的催化剂,还有助于阐明酶的结构一作用关系,并且有助于说明这些酶的对应异构体选择性。进一步的研究将在工程与酶的关系方面展开讨论。     

Penicillium expansum脂肪酶选择性拆分外消旋萘普生

为了实现固定化扩展青霉TS414(Penicillium expansum TS414)脂肪酶在有机相中对外消旋萘普生的高效拆分,实验考察了水分、温度、有机溶剂、酶浓度、醇结构和醇浓度对酶促拆分反应的影响,确立了优化的酯化反应条件为：异辛烷为溶剂,外消旋萘普生2.15 mmol/L,正丙醇34.3 mmol/L,固定化酶量12 g/L,水0.05%(j), 40℃恒温摇床中200 r/min反应100 h. 在此条件下,酯化拆分反应的转化率为48.3%. 结果表明,固定化Penicillium expansum脂肪酶是一种较为理想的用于外消旋萘普生拆分的工具酶.     

2-烯丙基-4-羟基-2-环戊烯酮的脂肪酶动力学拆分

2-烯丙基-4-羟基-2-环戊烯酮是合成前列腺素PGI1的关键中间体,具有重要的药用价值。该文用改进的方法合成了(±)-2-烯丙基-4-羟基-2-环戊烯酮,总收率27%,用脂肪酶对其进行动力学拆分,得到光学纯的(S)-环戊烯酮醇。结果表明,猪胰脂肪酶具有最佳的拆分效果。以乙酸乙烯酯同时作为溶剂和酰化供体,在25℃,m(酶)∶m(醇)=1.5∶1条件下,环戊烯酮醇的转化率为50.2%,(S)-醇的ee值为58.9%。采用同样条件进行二次酶动力学拆分,得到ee值>98%的手性烯酮醇,总拆分收率23%。     

膜材料的亲疏水性对固定化脂肪酶的影响

用吸附法固定脂肪酶时,膜材料的亲疏水性对固定化酶的量、比活力和活力稳定性等有很大影响.今以柱状假丝酵母脂肪酶和猪胰脂肪酶为研究对象,选取了8种亲疏水性不同的膜材料(醋酸纤维素、聚丙烯腈、聚酰胺、聚砜、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、聚丙烯和聚四氟乙烯)作为固定化载体,用吸附法制备了固定化脂肪酶膜.研究结果表明,强疏水性聚四氟乙烯和聚丙烯膜对两种酶的吸附量都比较大,且固定化酶的比活力和活力回收率比较高,聚四氟乙烯固定化柱状假丝酵母酶比游离态酶的半衰期提高了6倍以上.强亲水性醋酸纤维素膜对猪胰脂肪酶的吸附量比聚四氟乙烯高,但是固定化酶的比活力、活力回收率比强疏水性膜低,而接触角在40°～50°的聚酰胺膜和聚砜膜的吸附量最小.因此吸附法制备固定化脂肪酶膜,选择聚丙烯膜和聚四氟乙烯膜是合适的,制备的优化条件为吸附温度25℃,酶溶液的pH为7.5,吸附时间10 h.     

扩展青霉脂肪酶的生产及其在外消旋烯丙醇酮拆分上的应用

试图应用脂肪酶催化拆分法代替化学法拆分外消旋烯丙醇酮(4-羟基-3-甲基-2-(2-烯丙基)-2-环戊烯-1-酮,allethrolone).以Rodamine B平板筛选法获得了一株脂肪酶高产菌Penicillium expansum PED-03,并对该菌液态发酵产脂肪酶的主要工艺参数进行了优化.确立了0.5%的淀粉和4% 的豆饼粉为该菌种的适宜碳源和氮源,最适C/N为0.5.Tween-80对产酶有明显的促进作用,添加0.05% Tween-80后所产酶活力可提高55%.发酵罐产酶试验结果表明,搅拌速度对脂肪酶的产生有明显影响,适宜的搅拌速度为500 r·min-1. 利用P. expansum PED-03脂肪酶在非水相中对外消旋烯丙醇酮进行手性拆分,反应36 h时转化率(C)可达理论值的96%,产物的对映体过量值(eeP)可达99%,显示了该酶在烯丙醇酮的酶法拆分方面具有良好的应用潜力.的淀粉和4% 的豆饼粉为该菌种的适宜碳源和氮源,最适C/N为0.5.Tween-80对产酶有明显的促进作用,添加0.05% Tween-80后所产酶活力可提高55%.发酵罐产酶试验结果表明,搅拌速度对脂肪酶的产生有明显影响,适宜的搅拌速度为500 r·min-1. 利用P. expansum PED-03脂肪酶在非水相中对外消旋烯丙醇酮进行手性拆分,反应36 h时转化率(C)可达理论值的96%,产物的对映体过量值(eeP)可达99%,显示了该酶在烯丙醇酮的酶法拆分方面具有良好的应用潜力.