丙酮丁醇梭菌发酵条件优化研究

以P2培养基为基础组分,分别通过改变初始葡萄糖浓度、初始酵母膏浓度以及初始pH值,研究这3个单因素对丁醇发酵的影响,确定了培养基的较佳条件:初始葡萄糖浓度60g/L、初始酵母膏浓度3g/L、初始pH值6.8.此外,采取接种量5％、发酵温度37℃、发酵时间72h,可使总溶剂浓度(丁醇、丙酮、乙醇)达到13.52g/L,其中丁醇、丙酮、乙醇浓度分别为8.83g/L、3.90g/L和0.79g/L,丁醇比例为65.31％.糖丁醇转化率为21.1％(平均值),糖总溶剂转化率为31.3％(平均值).     

毛细管气相色谱法分析丙酮和丁醇发酵产物

建立了毛细管气相色谱法,测定丙酮和丁醇发酵产物中丙酮、丁醇、乙醇含量的方法。采用HP-INNO- WAX(19091N-236)毛细管柱(60m×0.251mm×0.50μm),氢火焰离子化检测器(FID),柱温程序升温,以高纯氮作为载气,流速1mL/min,分流比90:1,进样量1.0μL,以内标法定量。在确定的色谱条件下,乙醇、丙酮、丁醇线性关系良好,线性回归系数≥0.9993,平均回收率在99.2%～99.8%,相对标准偏差≤2.50%,最低检测限分别为0.10μg/mL,0.12μg/mL和0.20/μg/mL。该方法简单,灵敏度高,重复性好,结果准确,适合用于丙酮和丁醇发酵产物的检测。     

丙酮丁醇产生菌的筛选、鉴定及其产丁醇性能优化

由于丁醇对生产菌的抑制甚至毒害作用导致丙酮丁醇发酵过程中出现低产物浓度、低产率现象是目前生物法获取丁醇过程中亟待解决的一个关键科学问题。为获得高丁醇耐受性及高丁醇产量生产的菌株,该文采用自行设计的"三明治"筛选方法,从土壤中筛选出4株高丁醇耐受性菌株,其中菌株a914的发酵性能最佳,经P2培养基和木薯粉培养基发酵后其丁醇的产量分别为5.44和3.02 g/L。菌株a914经16S r DNA鉴定其与拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的同源性高达99%,以及结合菌株a914的生理生化特性最终确定菌株a914为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)。同时还对菌株a914的发酵性能进行了初步研究,试验结果表明,其最适的木薯粉浓度为80.0 g/L、酵母浸粉浓度为3.0 g/L、碳酸钙添加量为3.0 g/L,在此条件下丁醇和总溶剂产量分别达到6.73和9.83 g/L。     

利用丙酮丁醇发酵废水偶联乙醇发酵的研究

研究以一株从自然环境中分离得到的酿酒酵母GXAS—BT9作为发酵菌株,利用丙酮-丁醇发酵的废液作为乙醇发酵的配浆用水,进行乙醇发酵。结果表明,GXAS—BT9菌株的乙醇发酵产率随着废液比例的升高而增加,使用100％废液作为配浆用水,玉米粉和木薯粉作为原料的乙醇产率分别达到14．27％vol和14．26％vol,比对照分别提高了14．7％和9．6％。将丁醇发酵与乙醇发酵偶联起来,实现了水的循环利用,同时大大减少了污水的排放量。     

丙酮丁醇梭菌代谢工程菌的构建及其发酵性能

丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum可以利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖等多种底物,发酵糖获得丙酮、丁醇、乙醇等产物,是一种优良的木质纤维素同步糖化发酵菌种。为获得具有更优良发酵性能的木质纤维素发酵菌株,使用代谢工程技术对丙酮丁醇梭菌进行改造。将乙酰乙酰CoA硫解酶基因(thl)的启动子和末端两个同源片段以及醛/醇脱氢酶基因(adhE)的开放阅读框连接到pUC18上,构建成整合型质粒pTAEE,电转化丙酮丁醇梭菌后在红霉素抗性平板筛选转化子。通过PCR扩增及产物序列分析表明,质粒pTAEE中的adhE基因以单交换的方式整合到转化子基因组中,增强adhE的表达。重组菌T4的乙醇得率为2.3%,比野生菌提高了15%,乙醇浓度为0.39 g/L,与野生菌相当;丁醇得率为41.6%,比野生菌提高了69%,丁醇浓度为6.9g/L,比野生菌提高了41%,获得了发酵性能更高的丙酮丁醇梭菌代谢工程菌株。     

糖蜜发酵生产丙酮丁醇菌种筛选及其发酵条件的选择

从糖厂污泥中分离出４株厌氧梭状芽孢杆菌,共分别编号为ＣＬＳ．００１,００２,００３,００４。经初筛其ＣＬＳ．００４具有较高的丙酮丁醇发酵力。以它为菌种,用糖蜜作原料进行发酵条件正交试验,选出其发酵的最佳条件：在糖蜜浓度１０～１５Ｂｘ;３５～３８℃;ｐＨ６．８～７．２条件下,总溶剂生成率和糖的利用率分别可达到３０％和８５％以上。     

基于遗传算法优化BP神经网络的丙酮丁醇梭菌发酵预测模型研究

为了提高丙酮丁醇梭菌发酵过程中生物量浓度预测的精度,以不同发酵时间和葡萄糖浓度下的生物量数据作为训练和测试集,构建BP人工神经网络,并利用遗传算法(GA)的全局搜索能力,优化构建BP人工神经网络权值和阈值,建立GA-BP预测丙酮丁醇梭菌生物量的预测模型.结果表明采用GA-BP算法具有比BP人工神经网络更高的预测精确度和稳定性.     

perR基因的敲除对丙酮丁醇梭菌摇瓶发酵的影响

为了提高丙酮丁醇梭菌对分子氧的耐受能力,降低厌氧发酵环境,构建了超氧化物阻遏蛋白(PERR)基因敲除的工程菌株。应用Ⅱ组内含子敲除系统,PCR克隆perR-Targetron基因与载体连接构建敲除质粒pSYperR,电转化丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ATCC 824,PCR筛选验证获得突变菌株C.acetobutylicum ATCC 824-ΔperR,采用摇瓶发酵对其突变菌株进行发酵性能研究。结果表明:静止状态发酵丁醇C.acetobutylicum ATCC824-ΔperR比C.acetobutylicum ATCC 824丁醇产量提高7.89%,摇床转速为200 r/min时,C.acetobutylicum ATCC824-ΔperR的丁醇产量是C.acetobutylicum ATCC 824的3.34倍。研究表明,通过Ⅱ组内含子敲除系统,构建的C.acetobutylicum ATCC824-ΔperR在发酵过程中降低了氧分子的伤害,不需要严格的厌氧条件,从而降低发酵成本。     

堀越氏芽孢杆菌S184产河豚毒素的发酵条件优化

采用快速有效的数学统计方法对堀越氏芽孢杆菌(Bacillus horikoshii)S184产河豚毒素的发酵条件进行了优化。利用Plackett-Burman设计,从众多影响产河豚毒素的因素中筛选出影响较大的3个因素:蛋白胨、磷酸盐质量浓度和接种体积分数。在此基础上,再利用响应面法中的杂合设计进行优化,通过拟合得到响应曲面函数,并获得了最佳的实验条件。在该实验条件下,河豚毒素产量从666.65 ng/L提高到1 900.60 ng/L。     

葡萄糖浓度对产丁醇芽孢杆菌菌体生长与代谢特性的影响

研究了在兼性厌氧条件下初始葡萄糖浓度对产溶剂芽孢杆菌(Bacillus sp.)C2菌株菌体生长和代谢特性的影响。结果表明:5%初始葡萄糖浓度下菌体的生长速率低于低糖浓度的处理;随发酵产物浓度升高,部分菌体变长;前芽孢及成熟芽孢数量在发酵过程中变化不明显。2%、4%和5%初始糖浓度下,总溶剂产量分别在发酵的72、54和90 h达到最高值,为5.49、11.96和18.4 g/L,其中丁醇占70%,总溶剂的产率分别为0.309、0.303和0.366 g/g。3%初始糖浓度发酵时,发酵于36 h前停止,溶剂产量仅为2.4 g/L。     

Plackett-Burman和Box-Benhnken Design实验设计法优化华根霉产糖化酶发酵培养基的研究

应用Plackett-Burman设计法对影响华根霉发酵的培养基组分进行筛选,所选取的11个相关因素为:葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、橄榄油、蛋白胨、黄豆粉、酪蛋白胨、麦麸、MgSO4·7H2O、K2HPO4、KH2PO4。确定影响产糖化酶活的关键因素为橄榄油、酪蛋白胨、麦麸,接着进行最陡爬坡实验逼近3个关键因素的最大响应区域。在此基础上,采用Box-BenhnkenDesign实验设计法对发酵培养基组分进行优化,得出最佳条件。此时橄榄油为0.01%、酪蛋白胨为8.14%、麦麸为4.32%、糖化酶活为18.7U,比优化前提高81%。     

PBD-BBD优化大枣保质工艺

针对大枣含水含糖量高易生霉长蛀问题,以灵武长枣干枣为原料,杀菌率为响应值,在单因素实验基础上,通过Plackett-Burman design试验从5个因素(ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比、杀菌方式、杀菌温度、杀菌时间、包装方式)中筛选出对杀菌率有主要影响的3个因素(ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比、杀菌温度、杀菌时间)。通过Box-Behnken design试验优化,建立3个因素对杀菌率的二次多项回归方程模型。结果表明,优化保质工艺为:ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比0.08 g/kg,固定杀菌方式为巴氏杀菌,巴氏杀菌温度为75℃、时间为40 min,包装方式为充氮包装,此时杀菌率为98.00%。研究表明该优化保质工艺能够使干枣变成免洗枣,延缓了微生物的生长,使菌落总数达到免洗标准。     

中心复合法优化Blakeslea trispora产番茄红素的发酵条件

用中心复合法对Blakeslea trispora霉菌发酵产番茄红素条件进行了优化。首先通过Plackett-Burman设计试验,对影响番茄红素产量的8个相关因素进行了评估并筛选出具有显著效应的2个因素:装液量和接种量。再采用中心复合法确定出最佳装液量和最佳接种量,分别为53.99 mL和9.279%。优化后,发酵培养基中番茄红素含量达到0.762 3 g/L,比初始番茄红素产量提高了30.31%。     

重组大肠杆菌产脂肪氧合酶发酵条件优化

为进一步提高重组大肠杆菌（pET-23a-pse-LOX）产脂肪氧合酶（lipoxygenase,LOX）的酶活力,利用响应面法对其发酵条件进行优化。通过单因素试验确定诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度、接种量、培养基初始pH值和装液量对其发酵产酶的影响。在此基础上,采用Plackett-Burman试验设计从7 个因素中筛选出对LOX产量具有显著效应的因素为诱导时机、诱导时间和培养基初始pH值,并利用Box-Behnken试验设计和响应曲面法分析以确定其产酶的最优发酵条件,即诱导时机为菌液OD600 nm达到1.6、诱导时间34 h、培养基初始pH 7.0。在此条件下,LOX酶活力为（21 261.60±264.03） U/mL,比优化前的（13 553.96±46.64） U/mL提高了56.87%。     

植物乳杆菌fmb10产细菌素发酵条件的优化

通过单因素试验对影响植物乳杆菌fmb10发酵产细菌素的8 个影响因子进行初筛,采用Plackett-Burman设计法确定显著影响因子,利用最陡爬坡试验逼近最佳响应面区域,运用Design-Expert软件的中心组合试验设计（central composite design,CCD）对显著影响因子的重要水平和交互作用进行研究。结果表明,菌株fmb10产细菌素的最佳发酵条件为：发酵温度30.38 ℃、葡萄糖质量浓度21.1 g/L、酵母膏质量浓度11.0 g/L,在此条件下,植物乳杆菌fmb10发酵上清液对大肠杆菌抑菌圈直径平均为22.90 mm,与预测值22.89 mm高度吻合,优化后植物乳杆菌fmb10发酵上清液抑菌圈直径较原始抑菌圈直径（18.37 mm）提高了24.66%。     

纳豆激酶发酵条件的优化

利用Plackett-Burman 方法对影响纳豆芽孢杆菌液体发酵的各因素进行评价,筛选出对产纳豆激酶有显著效应的主要因素是豆饼粉浓度。在此基础上,用响应面分析法对发酵培养基中的豆饼粉浓度、CaCl2 浓度、葡萄糖浓度进行优化。所得的最优培养基成分为葡萄糖 1%、豆饼粉 3%、KH2PO4 0.2%、K2HPO4·3H2O 0.26%、MgSO4·7H2O 0.1%、CaCl2 0.12%。拟合实验结果显示,纳豆激酶液体发酵液的酶活由初始培养条件的约1800U/ml提高到优化后的2226.06U/ml。     

植物乳杆菌胞外多糖发酵条件的优化

目的：对植物乳杆菌胞外多糖的发酵条件进行优化。方法：采用Plackett-Burman法从影响植物乳杆菌胞外多糖(EPS)产量的14个因素中筛选出3个主要影响因素,然后通过响应面法探讨最优工艺参数。结果：影响植物乳杆菌胞外多糖产量的主要因素是蔗糖质量浓度、接种量以及发酵温度,其最佳条件为蔗糖质量浓度34g/L、接种量5%、发酵温度31℃,在此条件下发酵的植物乳杆菌胞外多糖产量达425.16mg/L。结论：应用Plackett-Burman设计和响应面法进行植物乳杆菌胞外多糖发酵条件的优化是可行的。     

利用Box-Benhnken设计优化糯玉米汁加工工艺

运用Box-Benhnken模型对糯玉米汁澄清工艺进行研究。结果表明:(1)糖化效果的影响因子主次顺序为:糖化温度>糖化时间>加酶量,分别达到0.1%,1%和5%显著水平;pH对糖化效果影响不显著。(2)利用响应面和等高线分析得出加工工艺的回归拟合方程,结果表明回归模型准确有效。(3)糖化酶0.045%、糖化时间3 h、糖化温度60℃、pH值4.5条件下糖化,随后按1︰10料水比稀释,最终以10 000 r/min离心10 min,据此可实现最佳澄清效果。     

以浒苔为碳源的地衣芽孢杆菌发酵产蛋白酶条件优化

为了优化地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）以浒苔（Enteromorpha prolifera）为碳源进行发酵产蛋白酶的能力,以蛋白酶比活力为指标,通过单因素试验探讨不同因素对产酶效率的影响,在此基础上运用Plackett-Burman设计筛选出了3 个显著因素：培养基初始pH值、浒苔添加量和NaH2PO4添加量。采用响应面法对这3 个显著因素进行优化,得到最佳产酶条件为培养基初始pH 6.66、浒苔添加量4.65%、NaH2PO4添加量0.027 4%,此条件下蛋白酶比活力预测值为66 354.70 U/g pro,3 次实验验证值为66 966.37 U/g pro。验证值与基础发酵条件下的最大蛋白酶比活力18 206.16 U/g pro相比,提高了2.68 倍。