结核杆菌Ag85A蛋白与日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶的融合表达与纯化

目的　对结核杆菌Ag85A抗原基因进行克隆、表达与纯化 ,为研制新型结核杆菌血清学诊断试剂奠定基础。方法　以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,经PCR扩增Ag85A抗原基因成熟肽编码区 ,定向克隆入原核表达载体pGEX1 λT中日本血吸虫谷胱苷肽硫转移酶 (GST)编码区下游构建重组质粒 ,经DNA测序鉴定后 ,转化大肠杆菌JM10 9株 ,IPTG诱导表达 ,采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化 ,SDS -PAGE和Westernblot鉴定重组表达产物。结果　PCR扩增获得了约 90 0bp的目的基因片断 ,定向克隆入原核表达载体pGEX1 -λT后 ,对重组质粒进行DNA测序发现 ,插入片段与GenBank中结核杆菌Ag85A抗原基因成熟肽编码区同源性为 99 .8%。重组质粒转化大肠杆菌后 ,经IPTG诱导表达 ,纯化的融合蛋白相对分子质量为 5 80 0 0 ,Westernblot检测该融合蛋白能与兔抗结核杆菌多价抗血清发生反应。结论　本研究为研制结核杆菌血清学检测试剂盒及相关分子免疫学研究奠定了基础。     

破伤风毒素C片段的基因克隆、重组表达及免疫原性

应用PCR技术直接从破伤风芽孢杆菌质粒DNA中扩增出 1 4Kd的破伤风毒素C片段基因 ,经DNA序列测定证明其为破伤风片段C基因。将此基因克隆入大肠杆菌谷胱甘肽 S 巯基转移酶融合表达载体pGEX 4T 2 ,构建成重组表达质粒pGEX TC。经SDS PAGE蛋白电泳鉴定 ,表达产物为 76Kd的特异性重组蛋白。免疫印迹实验证实 ,重组蛋白抗原是破伤风C片段抗原。动物实验证明此重组抗原具有良好的免疫原性 ,1μg免疫剂量可使动物产生 1～ 2IU/ml的破伤风抗毒素 ,ELISA抗体滴度可达 1∶80 0。     

HCV核心抗原N-端片段生物素化表达质粒的构建及表达

目的构建HCV核心(C)抗原N-端1～130aa片段的生物素化表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达。方法PCR扩增HCV C抗原N-端1～130aa片段的编码基因,拼接上生物素-蛋白连接酶底物肽序列(BSP),构建重组原核表达质粒pGEX4T-1-CN130BSP,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE后,电转至硝酸纤维素膜上,以抗HCVC抗原的单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素对表达产物进行分析。结果PCR扩增出约466bp的目的基因片段;质粒pGEX4T-1-CN130BSP经PCR及双酶切鉴定,与预期结果一致,测序鉴定基因无突变;SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约为42000,22℃诱导16h可溶性表达产物含量较高;表达的重组蛋白可被抗HCV C抗原的单克隆抗体所识别,并能特异性结合辣根过氧化物酶标记的亲和素。结论已成功构建了HCV C抗原N-端1～130aa片段生物素化表达质粒,并表达出带生物素标签的GST融合蛋白,为进一步研制HCV双抗原夹心检测试剂奠定了基础。     

人类免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白(Gag)在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白Gag,为HIV感染的诊断和疫苗的研制奠定基础。方法通过PCR扩增获得HIV1gag基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX5X1的tac启动子下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDSPAGE和Westernblot分析验证其表达产物。结果表达产物是相对分子质量为82000的GST融合蛋白,且能与抗p24单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Gag蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达,且具有良好的抗原性,可进一步用于HIV感染及动物免疫等方面的研究。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D胞外区片段在哺乳动物细胞中的表达及其免疫活性

目的在哺乳动物细胞中表达单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes simplex virus type-2,HSV-2)糖蛋白D(GlycoproteinD,gD)胞外区片段,并分析其免疫活性。方法化学合成HSV-2 G株gD蛋白胞外区片断的基因序列gDt,以pCEP4作为表达载体,构建N-末端带His标签的重组表达质粒pCEP4-gDt,转染至HEK293细胞进行表达。表达的蛋白采用镍离子柱亲和层析纯化,ELISA法检测目的蛋白的抗原性。以纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多抗血清,间接ELISA法检测效价。结果重组表达质粒经PCR、双酶切和DNA测序证实构建正确;表达产物经Western blot分析,在相对分子质量约46 000处可见目的蛋白条带;纯化的重组蛋白浓度约为45μg/ml,经ELISA检测证实具有良好的抗原性,免疫小鼠5周后,血清中特异性抗体效价达5×103。结论已在哺乳动物细胞中表达了HSV-2 gD胞外区片段,其具有良好的抗原性和免疫原性,为HSV基因重组亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

人心肌肌酸激酶MB同工酶的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人心肌肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase MB,CK-MB)。方法分别从含CK-M、CK-B基因片段的质粒SC319293和SC119007中扩增CK-M、CK-B基因,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-CK-MB,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,经GST亲和层析柱纯化后,ELISA法检测其抗原性。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-CK-MB经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组CK-MB蛋白相对分子质量约110 000,表达量占菌体总蛋白的57%,主要以包涵体形式存在;纯化的CK-MB蛋白纯度大于90%,可与兔抗CK-B、CK-M多克隆抗体特异性结合。结论成功原核表达并纯化了重组CK-MB蛋白,为其大量生产奠定了基础。     

HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别肽的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别肽sk1、sk2、sk3及3条肽段串联序列。方法用普通PCR及重叠延伸PCR法从HIV-1 B亚型质粒扩增得到sk1、sk2、sk3基因序列及3条肽段基因片段的6种连接序列,并分别克隆入原核表达载体pET-32a(+)及pGEX4T-2中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Ni-NAT或谷胱甘肽-Sepharose-4B层析柱亲和层析纯化。SDS-PAGE分析融合肽的表达,Western blot分析融合肽的抗原性。结果分别以pET-32a(+)和pGEX4T-2为载体,共构建了18个重组表达质粒;his-sk1、his-sk123、his-sk213、his-sk231及GST-sk3、GST-sk123、GST-sk213分别在pET-32a(+)及pGEX4T-2表达载体中以可溶形式表达,且均能与HIV-1阳性血清反应,而不能与HIV DNA-天坛疫苗免疫血清反应;经大量诱导表达纯化后,GST-sk3表达量最高,可达40 mg/L,纯度超过90%。结论已成功表达并纯化了具有生物学活性的HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别肽,为研制HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别诊断试剂盒奠定了基础。     

HCV核心区全基因片段的表达及产物抗原活性分析

目的 表达并纯化核心基因全片段,以得到良好特异性的核心蛋白。方法 自克隆载体pUC19/HCV-C中切下核心基因全片段,将其插入带有His 6纯化标签的融合表达质粒pTrcHisA中,转化入大肠杆菌,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE、中和抑制ELISA和Western blot对占菌体总蛋白15％以上的表达产物进行鉴定,用IMAC一步法纯化,纯化产物检测HCV阴阳性血清标本,并与日本东燃公司核心抗原C_(11)检测结果进行比较。结果 核心基因全片段插入pTrcHisA载体,转化入大肠杆菌TOP10后构建成功稳定的表达株PTrcHisA/HCV-C/TDP10,用纯化产物检测血清标本,与日本东燃公司核心抗原C_(11)检测结果的阳性均值与阴性均值之比及A值分布基本相同。结论 表达抗原具有良好的免疫反应性和特异性。     

弓形虫P30蛋白抗原表位的克隆表达及纯化鉴定

目的构建表达P30蛋白抗原表位的重组质粒及工程菌,获得纯化的P30蛋白抗原表位,用于检测弓形虫特异性抗体。方法采用PCR技术,设计一对引物(P30P3、P30P4),从弓形虫基因组DNA中扩增出编码P30蛋白抗原表位的基因片段,与载体pET28a(+)连接,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDSPAGE分析。用离子交换纯化表达的P30抗原表位,用ELISA鉴定其抗原性。结果表达的P30蛋白抗原表位以包涵体形式存在,纯化的P30蛋白抗原表位片段有较好的抗原性,可用于检测弓形虫抗体。结论已成功构建了高表达P30蛋白的工程菌,为研制弓形虫抗体检测试剂或疫苗奠定了基础。     

人胎盘泌乳素的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人胎盘泌乳素(Human placenta lactogen,hPL)。方法从正常产妇新鲜胎盘组织中提取组织总RNA,PCR扩增hPL基因,将其亚克隆至pQE-30载体,构建重组表达质粒,转化感受态大肠杆菌M15(pREP4),经IPTG诱导表达。表达产物经Sephacryl S-200层析柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE和western blot鉴定其纯度和特异性。结果重组菌pQE-hPL/M15(pREP4)经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约23 000,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的67%;纯化后目的蛋白纯度可达90%以上;纯化蛋白和hPL包涵体均可与羊抗hPL多克隆抗体特异性结合,具有较强的特异性和抗原性。结论已成功制备了纯度较高的hPL蛋白,为基因工程制备抗体提供了抗原。     

胸腺素α1的基因合成、表达及活性测定

目的　合成胸腺素α1(Tα1)基因并在原核细胞中表达。方法　用半酶半化学合成并克隆Tα1基因 ,将该基因插入表达质粒pGEX 4T 1并在大肠杆菌进行表达 ,对表达的融合蛋白GST Tα1利用亲和层析法纯化 ,再经Thrombin酶切后 ,获得重组Tα1进行生物学活性检测。结果　经测序证实合成的Tα1序列与设计的一致。构建的重组表达载体pGEX 4T 1 Tα1在大肠杆菌中得到高效表达。E玫瑰花结形成试验证明重组Tα1具有生物学活性。结论　合成的Tα1基因在大肠杆菌中表达出具有生物活性的蛋白。     

HIV-1型衣壳蛋白P24在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

用聚合酶链式反应 (PCR)从 HIV - 1gag基因序列中扩增出衣壳蛋白 (P2 4)基因 ,插入表达载体p GEX- 4T3中 ,构成重组质粒 p GEX- p2 4,在大肠杆菌 BL 2 1中高效表达出重组 P2 4。经 Glutathione- Sepharose4B亲和层析纯化后 ,重组 P2 4在间接 EL ISA和免疫印迹中表现出很高的抗原特异性和免疫反应性。     

人巨细胞病毒gp52蛋白基因片段的克隆及表达

目的为获得高表达人巨细胞病毒 ｇｐ５２蛋白基因的工程菌。方法通过计算机分析,筛选出巨细 胞病毒蛋白ｇｐ５２中优势抗原决定簇,用ＰＣＲ技术扩增克隆了含强抗原决定簇的基因片段。将克隆的基因片段插 入表达载体ｐＥＴ２８（ａ）内,转化大肠杆菌ＢＬ２１,经Ｓｅｐｈａｒｅｒｙ１ Ｓ－２００分子筛及Ｎｉ－ＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ螯合层析进行纯化。结 果获得的工程菌所表达的 ｇｐ５２蛋白片段相对分子质量约为 ２１ ０００,约占菌体可溶性蛋白的 ２８％。获得的表达蛋 白纯度达９５％,电泳显示单一条蛋白带,ＥＬＩＳＡ分析证实有较强的抗原性和较好的特异性。结论本研究对人巨细 胞病毒感染,尤其是对孕妇及献血员等感染的检测有重要意义。     

人溶菌酶-抗菌肽tachyplesins融合蛋白的原核表达及其抗菌活性

目的原核表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLYZ)和抗菌肽tachyplesins融合蛋白,并检测其抗菌活性。方法人工合成抗菌肽tachyplesins基因和linker,与pMD18-T-hLYZ上切下的hLYZ基因融合,将融合基因克隆至带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达条件进行优化。表达的融合蛋白经亲和层析纯化后,进行抗菌活性检测。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-hLYZ-tachyplesins经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约44000处可见目的蛋白条带,诱导温度在25℃,IPTG终浓度为0.8mmol/L,诱导时间为6h,融合蛋白表达效果较好,主要以可溶性形式存在;纯化的融合蛋白纯度可达90%以上,对金黄葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的抑制作用。结论已成功在原核细胞中表达了人溶菌酶-抗菌肽tachyplesins融合蛋白,纯化的融合蛋白具有一定的抗菌活性。     

重组SARS病毒N蛋白的制备及其初步应用

目的在大肠杆菌中表达重组SARS-CoVN蛋白,并进行纯化,为进一步研制SARS早期诊断试剂奠定基础。方法通过RT-PCR获得SARS-CoVN蛋白基因片段,并克隆至大肠杆菌表达载体pQE30中,构建重组质粒。转化E·coliM15,IPIG诱导表达。经SDS-PAGE和Western blot鉴定,采用Chelating-Sepharose Fast Flow纯化融合蛋白,并免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清抗体水平。结果所构建的重组表达载体pQE30-N经诱导可表达重组SARS病毒N蛋白。该蛋白纯化后,纯度可达90%左右。Western blot检测表明,重组SARS病毒N蛋白可与SARS患者恢复期血清呈现特异的免疫反应。免疫BALB/c小鼠可获得高效价抗血清。结论重组SARS-CoV N蛋白具有良好的抗原性,可用于SARS-CoV感染的早期诊断。     

结核分枝杆菌Rv0057-Rv1352融合蛋白的制备及其初步应用

目的制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)Rv0057-Rv1352融合蛋白,并通过化学发光酶免疫法分析其抗原性,以评价其应用价值。方法根据Rv0057和Rv1352蛋白序列,合成Rv0057和Rv1352基因片段并进行扩增,分别插入质粒pET30aSETB中,构建重组质粒Rv0057/pET30aSETB和Rv1352/pET30aSETB。用NheⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒Rv1352/pET30aSETB,SpeⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒Rv0057/pET30aSETB,将回收的Rv1352基因片段插入Rv0057/pET30aSETB质粒中,构建重组质粒Rv0057-Rv1352/pET30aSETB,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的包涵体蛋白经His.Bind蛋白纯化试剂盒纯化后,以其作为抗原建立化学发光酶免疫分析法,检测患者血清中抗结核抗体,并与市售M.tb抗体诊断试剂盒和痰涂片法进行比较。结果构建的重组质粒Rv0057-Rv1352/pET30aSETB的核苷酸序列与设计序列完全一致;表达的重组融合蛋白Rv0057-Rv1352相对分子质量约为30 500,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组融合蛋白的浓度为1.6 mg/ml,纯度为95%;以其为抗原建立的化学发光酶免疫分析法检测患者血清中抗结核抗体的灵敏度和特异性分别为66.70%和90.00%,而市售M.tb抗体诊断试剂盒的灵敏度和特异性分别为80.00%和63.33%;30例活动性肺结核患者经痰涂片检测,灵敏度为20.0%,化学发光酶免疫分析法检测灵敏度为66.7%,二者差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功制备了M.tb Rv0057-Rv1352融合蛋白,以其为抗原建立的化学发光酶免疫分析法检测抗结核抗体具有较高的灵敏度和特异性,在结核病血清学快速诊断方面具有广阔的应用前景。