条斑紫菜锰超氧化物歧化酶基因克隆与序列分析

为研究紫菜抗逆抗病的分子机制,以本实验室建立的条斑紫菜表达序列标签(EST)和全长cDNA富集文库,结合PCR技术,克隆了条斑紫菜编码锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的cDNA及基因组DNA全长序列,并进行了序列特性相关分析.研究结果表明:该基因cDNA序列全长为958个核苷酸,包含一个完整Mn-SOD基因的ORF,编码224个氨基酸和终止密码子;该基因在基因组中序列长度为1416bp,包含4个外显子和3个内含子,这既不同于高等植物的6个外显子和5个内含子,也不同于人的5个外显子和4个内含子;该基因编码区密码子的平均GC含量为60.9%,第三位密码子的GC含量高达84.9%;序列中包含4个与Mn2 的结合位点及一个保守的金属结合结构域,预测分子量为24469.09Da,等电点为5.99;条斑紫菜Mn-SOD与人的相关蛋白具有类似的空间结构,都有6个跨膜α螺旋结构域;由cDNA序列推导的氨基酸序列与莱茵衣藻相似性为57.7%,系统发生分析表明条斑紫菜Mn-SOD与绿藻莱茵衣藻和硅藻海链藻的亲缘关系较近.这是该基因在红藻门中的首次报道.     

β-半乳糖苷酶基因(lacZ)在海藻裙带菜中的稳定表达

借鉴海带遗传转化模式，利用基因枪法将β-半乳糖苷酶基因(lacZ)导入裙带菜雄配子体中，一部分诱导形成营养增殖的丝状体，另一部分和雌配子体受精生成孢子体。五个月后组织化学染色结果表明5％的孢子体个体和30％的丝状体细胞表现了lacZ的稳定表达，利用PCR和PCR-Southem检测得到了预期的阳性信号。本文结果提示了利用基因枪转化方法．以雄配子体介导获得外源基因在裙带菜中稳定表达的可行性．     

基因枪法建立紫菜丝状体遗传转化模式

以坛紫菜和条斑紫菜的自由丝状体为材料,利用基因枪法分别转化CaMV35S、SV40、FCP、Amt、Ubi 5种启动子与报告基因组合,转化后48h进行原位组织化学染色检测,首次针对重要经济红藻紫菜的自由丝状体建立并优化遗传转化技术,为紫菜研究提供了新工具。结果显示,SV40启动子可以驱动laeZ报告基因(编码β-半乳糖苷酶)在紫菜丝状体中的瞬间表达,空白与阴性对照未检测到本底;其它4种启动子未检测到基因表达。进一步优化实验发现,在可裂膜650psi、轰击距离6cm下获得最高转化效率为8.0×10~(-5),经定量检测与双因子方差分析,是最佳转化参数,提示基因枪参数对外源基因转化效率具显著影响。     

栉孔扇贝热休克蛋白70基因Cdna的克隆与分析

应用表达序列标签法，获得了栉孔扇贝HSP70基因cDNA的部分序列，然后利用锚定PCR技术克隆到了该基因的全长cDNA。克隆到的HSP70 cDNA全长2553bp，编码区全长1902bp，可以编码634个氨基酸。Blast分析表明该序列与其他生物的HSP70基因具有很高的相似性。在该cDNA序列编码的氨基酸序列中含有3个HSP70家族的特征模体，结合Blast分析的结果，可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝HSP70的编码序列。该基因的克隆为进一步深入研究栉孔扇贝的抗逆机理以及指导扇贝的遗传选育和遗传改良都具有重要的理论意义。     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达

肥胖基因编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。本文利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5’端的CCC转变为大肠杆菌常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆原核表达载体pT7-7,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经温度诱导,SDS-PAGE电泳可见分子量约为：16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的45％以上。表达重组蛋白经纯化,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

用差减抑制杂交方法鉴定太谷核不育小麦花药败育过程中的特异表达基因

以太谷核不育小麦败育花药为对照群体，可育花药为目标群体，进行抑制差减杂交。用经过败育花药差减的可育花药cDNA群体构建了一个差减抑制杂交文库。结果显示，插入片段的大小主要集中在300－500bp之间。随机选取8个克隆进行Northern杂交分析，结果其中7个克隆在可育花药和不育花药之间的表达存在差异。对其中16个插入cDNA片段测序后与GenBank同源性比较表明，共获得未重复序列13条，占81％，其中与已知功能基因同源的3条，与EST库中的序列同源的7条，新的cDNA片段3条。     

球毛壳菌部分表达序列标签的生物信息分析

球毛壳菌属于子囊菌门，是一种植物病害的广谱生物防治菌。为了解球毛壳菌的遗传背景和为生产上的应用打下基础，构建了球毛壳菌菌丝体的cDNA文库。测序产生了3507个可读序列，进一步分析时去掉小于100bp的短序列。用phrap软件对所获得的3116个表达序列标签(EsT)进行拼接，生成387个contigs和1023个singlets。BLAST分析表明513个单一基因是已知基因，897个单一基因代表新基因。通过E-mail从国际DNA数据库(DDBJ)取得了1410条序列的登录号。从已知基因中鉴定了3类生物防治相关基因。研究结果表明，利用EST途径鉴定球毛壳菌的基因是非常有效的，而且能为生物防治分子机理和生物防治基因表达产物生产技术的研究提供重要线索。     

真鲷转铁蛋白基因的克隆与表达特征分析

采用同源克隆的方法,根据相近物种转铁蛋白(Transferrin,TF)基因的序列设计简并引物,在经感染真鲷的cDNA上进行PCR扩增,获得了真鲷TF的全基因编码序列(GeneBank Accession No．AY335444)。该序列由2444bp核苷酸组成,含31bp5’非编码区和340bp3’非编码区以及2073bp的开放阅读框,可编码691个氨基酸,预测分子量约为74．3kD,等电点为5．63。同源性分析表明,真鲷TF与鱼类TF的相似性很高,约为65％～75％;与哺乳类转铁蛋白和乳铁蛋白的相似性约40％～50％;与脊索动物海鞘和无脊椎动物昆虫也有一定的相似性。进化分析表明,该基因是转铁蛋白而不是乳铁蛋白。真鲷TF与其它动物TF结构相似,是由两叶相似的结构域构成的单一肽链;该基因有一信号肽序列,缺乏糖基化位点,在它的两个结构域上,分别有三个TF家族的标签序列及一个MHC分子标签序列;与哺乳类相比,参与蛋白二硫键形成的半胱氨酸以及铁离子结合位点高度保守。RT-PCR结果显示,真鲷TF在肝脏成组成型表达,但在其它组织中的表达可受病原调控,表现为经病原刺激后转铁蛋白基因的组织分布显著增多。     

小白鼠缺氧信息的获得、传导和储存的分子机理研究

通过不同缺氧程度小白鼠模型,同时利用心肌组织的核DNA片段的基因体外表达和mRNA体外翻译,观察到了心肌缺氧信息获得、传导和储存的分子机理.观察结果表明:心肌等胞质中氧代谢相关的已有基因的开关蛋白质复合体等参与了人工轻度快速缺氧信息的获得;心肌等胞质中已有n mRNA链状复合体中mRNA迅速翻译出蛋白质,心肌等组织可传导较严重快速缺氧信息;心肌等细胞核内已有氧代谢相关的活性核基因迅速表达出自己编码的蛋白质,心肌等以储存较长时间严重缺氧信息.昆明种小白鼠在中国西藏拉萨郊区自然缺氧条件下饲喂30天,长期缺氧信息的储存分子机制与上述小白鼠较长时间严重缺氧模型类似,同时原有的和新形成的细胞的核DNA片段上的氧代谢等相关的核基因分别表达出较多蛋白质,并引起小白鼠的耳朵和尾巴增长等体型的明显变化.     

植物抗体基因工程：Ⅳ．马铃薯Y病毒小鼠中和抗体重链基因的序列分析及其植物表达

序列分析表明，马铃薯Ｙ病毒小鼠中和抗体重链基因（Ｇ９）全长为１５０５个核苷酸碱基（不包括Ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴），其中包括５＇端非编码区１６个核苷酸碱基、编码重链信号肽的５７个核苷酸碱基、编码成熟蛋白的１３２９个核苷酸碱基和３＇端非编码区的１０３个核苷酸碱基。与已知的小鼠抗体Ｍｏｐｃ２１的重链基因（γ１）相比，核苷酸的序列同源性为９４．４％，由核苷酸序列所推导出的氨基酸序列同源性为９２．６％，其中可变区内（ＶＨ）的氨基酸序列同源性达７４．５％，这表明二者起源于同一种系基因。将完整的抗体重链基因正向插入植物表达载体ｐＢⅠ１２１中的原ＧＵＳ基因位置上，置于花椰莱花叶病毒３５Ｓ启动子控制之下，获得了能够在植物细胞内表达马铃薯Ｙ病毒中和抗体重链基因的植物表达载体ｐＹＨ。     

条斑紫菜cDNA微阵列制备及其在世代差异基因表达检测中的应用

为了高通量研究不同世代条斑紫菜的基因表达情况,选择了467个包含诸多功能基因的条斑紫菜基因克隆,经PCR扩增纯化后,点样于多聚赖氨酸包被的基片上制备了条斑紫菜功能基因cDNA微阵列.采用Cy3-dCTP和Cy5-dCTP 荧光分别标记条斑紫菜配子体和孢子体cRNA,与阵列进行杂交后,获得了信号清晰、重复性良好的扫描图像.经对标准化处理后的467个基因的数据进行分析发现:在配子体中表达量上调的基因有55个,其中有21个基因与已知功能基因或推测功能基因相匹配;在孢子体中表达量上调的基因有86个,其中与已知功能或假定功能基因相匹配的基因有24个.实验证明,优化的cDNA微阵列制备技术用于条斑紫菜基因表达分析有较高的效率和可靠的实用性能.     

Regulatory network motifs and hotspots of cancer genes in a mammalian cellular signalling network

Mutations or overexpression of signalling genes can result in cancer development and metastasis. In this study, we manually assembled a human cellular signalling network and developed a robust bioinformatics strategy for extracting cancer-associated single nucleotide polymorphisms (SNPs) using expressed sequence tags (ESTs). We then investigated the relationships of cancer-associated genes [cancer-associated SNP genes, known as cancer genes (CG) and cell mobility genes (CMGs)] in a signalling network context. Through a graph-theory-based analysis, we found that CGs are significantly enriched in network hub proteins and cancer-associated genes are significantly enriched or depleted in some particular network motif types. Furthermore, we identified a substantial number of hotspots, the three- and four-node network motifs in which all nodes are either CGs or CMGs. More importantly, we uncovered that CGs are enriched in the convergent target nodes of most network motifs, although CMGs are enriched in the source nodes of most motifs. These results have implications for the foundations of the regulatory mechanisms of cancer development and metastasis.     

五个紫菜品系间遗传差异的RAPD分析

应用随机引物扩增片段多态性（RAPD）技术对2种紫菜的5个品系进行遗传多样性分析。共筛选出21条随机引物,PCR反应得到147条扩增片段。根据共享扩增片段计算遗传相似性指数（F）和相对遗传距离,利用NJ法构建系统树。结果表明,条斑紫菜或坛紫菜的养殖品系首先聚类在一起,两个条斑紫菜养殖品系之间的遗传距离是0．32,两个坛紫菜养殖品系之间的遗传距离是0．31。条斑紫菜养殖品系CPY1－08A与坛紫菜养殖品系CPH8－83之间的遗传距离最大,达0．42。本文结果显示RAPD可以作为简便有效的分子工具应用于紫菜的遗传多样性和种质鉴定研究中。     

抗稻瘟病新基因pi-hit-1的克隆与功能研究

采用差异显示法(DD-PCR)寻找易感稻瘟病的突变品系与野生型对照品系中的差异表达基因。结果发现与野生型对照相比,Rubisco小亚基、pi-hit．1(AF450251)和pi-hit-2(AF448491)基因在易感稻瘟病的突变品系中高表达,pi-hit-1和pi-hit-2是功能未知的新基因。进一步采用电子克隆和RT-PCR方法克隆了pi-hit-1基因的全长eDNA(AF514859),该基因编码的蛋白质属于ATP依赖的Clp蛋白酶家族。分析pi-hit-1基因的组织特异性表达发现,此基因在叶片组织特异表达。进一步设计接种诱导实验研究pi-hit-1基因表达与水稻稻瘟病易感性的关系。在易感稻瘟病的突变品系中pi-hit-1受稻瘟病菌诱导,接种后其表达量明显升高,而野生型对照品系pi-hit-1基因表达在接种前后无明显变化。比较易感稻瘟病的突变品系与对照品系pi-hit-1基因序列差异发现,稻瘟病敏感品系中pi-hit-1基因第一外显子发生缺失突变使pi-hit-1蛋白功能缺失,导致突变品系易感稻瘟病。这些实验结果提示野生型pi-hit-1是稻瘟病抗性基因。     

甜菜无融合生殖系花期差异表达基因cDNA文库的构建

为了克隆M14(M14是栽培甜菜与白花甜菜杂交产生的单体附加系,由于附加的白花甜菜第9号染色体上存在无融合生殖基因,其传递率可高达97.5%)品系中无融合生殖相关基因,应用抑制消减杂交方法,在甜菜开花的关键时期减数分裂期取样,建立了甜菜无融合生殖系M14与能够进行正常有性生殖的二倍体甜菜A2Y之间差异表达基因的cDNA文库,并对295个克隆进行了测序,共测得179个表达序列标签(Expressed Sequence Tags,ESTs),通过对生物信息学数据库资料的查询,共得到了89个与已知基因同源的ESTs,90个新的ESTs,选择其中2个EST进行了RT-PCR鉴定,证明在M14中特异表达.以上结果为以后克隆与无融合生殖相关的全长基因打下了基础.     

ESTMAP: a system for expressed sequence tags mapping on genomic sequences

The completion of a number of large genome sequencing projects emphasizes the importance of protein-coding gene predictions. Most of the problems associated with gene prediction are caused by the complex exon-intron structures commonly found in eukaryotic genomes. However, information from homologous sequences can significantly improve the accuracy of the prediction. In particular, expressed sequence tags (ESTs) are very useful for this purpose, since currently existing EST collections are very large. We developed an ESTMAP system, which utilizes homology searches against a database of repetitive elements using the RepeatView program and the EST Division of GenBank using the BLASTN program. ESTMAP extracts "exact" matches with EST sequences (>95% of homology) from BLASTN output file and predicts introns in DNA comparing ESTs and a query sequence. ESTMAP is implemented as a part of the WebGene system (http://www.cnr.it/webgene).     

Diatomics: toward diatom functional genomics

For diatom biologists one of the most interesting research areas over the next years will be in linking mathematical models for pattern formation with information derived from molecular genetic, biochemical, and physiological studies. A major goal of this research is to exploit diatom proficiency in biogenic silica formation to develop strategies for bio-inspired nanofabrication of silicon based materials. Development of high-throughput methods for the functional analysis of diatom genes is a key step toward this goal. In this article we review the different techniques available to investigate gene and protein function in diatoms. Furthermore, to make diatom research as effective as possible the research community must address the question of which diatom species should be developed as a model. Choice of a diatom model organism should be made on the basis of several criteria, such as the ease of genetic manipulation, ecological relevance, or biomineralization capability. Phaeodactylum tricornutum is one of the principal three species that are candidates for such a model. For this species we have accomplished the first large-scale analysis of 12000 expressed sequence tags (ESTs) and have organized it in a queryable database, Phaeodactylum tricornutum database (PtDB). A summary of the functional analysis of this EST collection is presented, and genes of particular interest are highlighted.     

PICquant: a quantitative platform to measure differential peptide abundance using dual-isotopic labeling with 12C6- and 13C6-phenyl isocyanate

We have developed a complete system for the isotopic labeling, fractionation, and automated quantification of differentially expressed peptides that significantly facilitates candidate biomarker discovery. We describe a new stable mass tagging reagent pair, (12)C(6)- and (13)C(6)-phenyl isocyanate (PIC), that offers significant advantages over currently available tags. Peptides are labeled predominantly at their amino termini and exhibit elution profiles that are independent of label isotope. Importantly, PIC-labeled peptides have unique neutral-mass losses upon CID fragmentation that enable charge state and label isotope identification and, thereby, decouple the sequence identification from the quantification of candidate biomarkers. To exploit these properties, we have coupled peptide fractionation protocols with a Thermo LTQ-XL LC-MS(2) data acquisition strategy and a suite of automated spectrum analysis software that identifies quantitative differences between labeled samples. This approach, dubbed the PICquant platform, is independent of protein sequence identification and excludes unlabeled peptides that otherwise confound biomarker discovery. Application of the PICquant platform to a set of complex clinical samples showed that the system allows rapid identification of peptides that are differentially expressed between control and patient groups.