共表达伴侣蛋白对毕赤酵母产β-甘露聚糖酶发酵过程的影响

通过分别共表达伴侣蛋白PDI和Bip获得β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达。根据Gen Bank公布的毕赤酵母PDI和Bip序列设计引物,以酵母基因组为模板PCR扩增目的基因片段,插入表达载体p PICZαA,分别整合到β-甘露聚糖酶工程菌中,筛选共表达二硫键异构酶的重组酵母(PM115)和共表达免疫球重链结合蛋白的重组酵母(BM115),在30 L发酵罐水平上分析两种共表达伴侣蛋白菌株与初始菌株(GM115)对β-甘露聚糖酶表达的差异。相同工艺下,PM115与原始菌株相比未有提高,而BM115发酵产酶能力高于原始菌株,最高酶活达到40 900 U/m L,最高总蛋白表达量13.22 g/L,最高比酶活达到3 150 U/mg,分别比初始菌株提高38%,22%和18%。毕赤酵母基因工程菌GM115通过共表达伴侣蛋白Bip,提高了β-甘露聚糖酶的产量和比活力,达到工业化生产水平。     

嗜热芽孢杆菌CHB1环糊精酶基因优化及其在毕赤酵母中的表达

为实现新型CGTase在毕赤酵母中的高效表达,提取嗜热芽孢杆菌CHB1基因组DNA为模块,PCR扩增野生型基因CGT1,编码680个氨基酸。将该基因进行密码子优化CGT2,与野生型基因CGT1分别插入分泌型载体pPICZαA转化毕赤酵母GS115,获得两株酵母工程菌GS115/pPICZαA-CGT1和GS115/pPICZαA-CGT2;经甲醇诱导表达120 h后,CGT2活力达0.62U/mL,是优化前CGT1(0.37 U/mL)活性的1.7倍;进一步对GS115/pPICZαA-CGT2进行摇瓶发酵条件优化,确定其最优发酵条件为:pH 6.5、28℃、200 r/min、每24小时补加体积分数1.5%的甲醇诱导,120 h后其胞外酶活力达到1.26 U/mL,是优化前的两倍。     

耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

将一种11家族极端耐热木聚糖酶的密码子优化基因Syxyn11克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-Syxyn11,将其经SalⅠ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。经G418筛选得到重组工程菌GS115/Syxyn11,用甲醇诱导表达重组木聚糖酶SyXyn11,酶活可达到17.74 U/mL。SDS-PAGE显示,SyXyn11的相对分子质量为31 000。SyXyn11的最适反应温度为85℃,在80℃以下稳定。最适反应pH为6.5,在pH 5.0~7.5范围内稳定。EDTA和大多数金属离子对重组酶的活性影响不大。结果表明Syxyn11成功在P.pastoris GS115中实现表达,而且重组木聚糖酶的耐热性并未改变。     

高产β-甘露聚糖酶黑曲霉菌株的分离与鉴定

该研究以采集的河南南阳魔芋种植土壤样品为试验材料,通过富集培养、测定产β-甘露聚糖酶酶活力,分离筛选高产β-甘露聚糖酶的菌株,并通过形态观察、内转录间隔区（ITS）基因和β-微管蛋白基因BenA序列分析对其进行菌种鉴定。结果表明,筛选得到一株高产β-甘露聚糖酶真菌菌株HKS016,其β-甘露聚糖酶酶活力为2.67 U/mL,该菌株被鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）,保藏于中国普通微生物学菌种保藏中心（CGMCC）,保藏编号为CGMCC No.22413。     

耐热赖氨酸氨肽酶毕赤酵母表达及培养条件优化

为实现耐热耐氨酸氨肽酶的异源表达,通过PCR扩增技术从Pseudomonas aeruginosa NJ-814基因组中克隆获得耐热的赖氨肽酶基因(PLAP),构建重组载体p PIC9K-PLAP,并最终实现在毕赤酵母GS115中的分泌表达。对重组毕赤酵母进行初步筛选,单因素实验优化获得重组毕赤酵母最佳诱导条件如下:诱导培养基初始pH为5.0、甲醇质量浓度1.5 g/dL、诱导温度28℃、装液量25 mL/250 mL、Co~(2+)浓度50μmol/mL、山梨醇添加量9 g/L。在最优条件下,氨肽酶酶活提高了5.2倍,比酶活2.74 U/mg。实验结果表明:PLAP基因已成功转入毕赤酵母GS115并获得表达。     

蚓激酶基因在毕赤酵母中的表达及其发酵条件优化

从赤子爱胜蚓体内克隆得到蚓激酶基因lks2,并成功在毕赤酵母GS115中表达,酶活为254. 4 U/mL。经摇瓶培养条件优化,确定最佳诱导条件为:初始OD_(600)=1. 5,pH 5. 5、温度28℃,此条件下诱导84 h,重组菌GS115-pPIC9K-lks2蚓激酶活峰值为397. 6 U/mL。利用10 L发酵罐进行放大培养,经优化确定最佳菌体接种浓度为9±0. 5 g/L,此条件下高密度发酵使前期培养时间缩短了11. 5 h,蚓激酶活力达到1 098. 2 U/mL,具有十分可观的工业应用潜力。     

β-甘露聚糖酶AuMan5Aloop/H321G在乳酸克鲁维酵母中的高效表达

为制备食品级β-甘露聚糖酶,将来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)的糖苷水解酶5家族β-甘露聚糖酶突变体基因(AuMan5A~(loop/H321G))克隆至表达质粒pKLAC1信号肽α-MF下游,构建重组表达质粒pKLAC1-AuMan5A~(loop/H321G),并电转化乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)GG799。采用半乳糖诱导表达和酶活性分析获得了高水平表达的重组β-甘露聚糖酶突变酶(reAuMan5A~(loop/H321G))的转化子GG799/AuMan5A~(loop/H321G),其产酶活力为54.9 U/mL。SDS-PAGE分析显示,reAuMan5A~(loop/H321G)的表观相对分子质量约为55 000。经YPG培养基初始pH、摇瓶装液量以及诱导剂的种类、初始质量浓度和添加方式的初步优化,GG799/AuMan5A~(loop/H321G)所产酶活力较工艺优化前提高了254.6%,从而实现了reAuMan5A~(loop/H321G)在乳酸克鲁维酵母中的高效表达。     

重组α-1,3-葡萄糖苷酶的毕赤酵母表达及发酵优化

Acremonium sp. S4G13来源的α-葡萄糖苷酶基因连接到p PIC9K载体上并在Pichia pastoris GS115中表达。在此基础上对重组菌P. pastoris GS115/pPIC9K-AGL产重组α-葡萄糖苷酶的发酵条件进行了单因素优化试验,结果表明最优条件为:生长阶段接种量10%,甘油体积浓度3%,初始pH 6.0;诱导阶段甲醇初始添加量1%,甲醇补加量0.5%,装液量10%,诱导温度25°C,山梨醇添加量6 g/L。在最优条件下发酵120 h,酶活可达7.8 U/mL,相比优化前酶活1.22 U/mL提升了5.4倍。     

产黄青霉β-甘露聚糖酶的高效表达、性质及应用

将产黄青霉（Penicillium chrysogenum）来源的β-甘露聚糖酶（PcMan26A）在毕赤酵母中高效表达,经高密度发酵,发酵液酶活力达25 200 U/mL。该酶属于GH26家族,与黑曲霉（Aspergillus niger）CBS 513.88来源的β-甘露聚糖酶同源性最高（67.8%）,是一个新型β-甘露聚糖酶。PcMan26A的最适催化条件为pH 6.0和50?℃,在pH?4.0～8.0和45?℃下具有良好的稳定性。该酶对魔芋粉具有最高的比活力,为3?581.0?U/mg。进一步利用该酶水解魔芋粉得到魔芋甘露寡糖,产品得率为86.2%;经分析,其主要组分为聚合度大于4的甘露寡糖。该β-甘露聚糖酶适用于生产魔芋甘露寡糖,为魔芋甘露寡糖的酶法生产提供了更多的选择。     

未培养微生物木聚糖基因真核表达及产酶条件优化

对来源于土壤宏基因组的未培养微生物筛选的木聚糖酶基因X1-19进行了毕赤酵母异源重组并对其产酶条件进行了优化。最佳的甲醇添加终体积分数为1%,接种密度为8×108个/mL,YNB的质量分数为1.2%,240 r/min,初始pH为5时,转化子产酶能力最高为(79.0±2.2)U/mL。研究为未培养微生物木聚糖酶基因的异源表达工业生产提供理论依据,具有较好的工业应用前景。     

产β-甘露聚糖酶菌株的筛选及其产酶培养基的优化

从土壤中分离筛选出5株产胞外β-甘露聚糖酶的菌株,其中XB2菌株的摇瓶培养液的粗酶活力达4.81U/mL。通过单因素实验和正交优化实验,确定了菌株产酶最适培养基组成(%)为:魔芋精粉1.5,NaNO3 0.3,MgSO4 0.3、KCl0.5、K2HPO40.1、FeSO4 0.001。此条件下酶活力高达9.12U/ml。     

产β-甘露聚糖酶的海洋微生物的筛选

以含有2%的NaCl培养基,从海泥、海水样品中用魔芋精粉为碳源,富集和分离产β-甘露聚糖酶的菌株,再经过平板水解圈初筛和发酵复筛得到稳定高产β-甘露聚糖酶的菌株L1。L1菌株的最佳生长条件包括:种龄12h、温度30℃,摇瓶装液量为100mL(250mL三角瓶),接种量为2%,摇床转速为160r/min,培养时间24h,β-甘露聚糖酶活力达到34.31U/mL。     

碱性β-甘露聚糖酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

为获得具有潜在工业应用价值的碱性β-甘露聚糖酶产生菌株,从自然土样中分离得到1株产酶性状较好的碱性细菌,经形态学和分子生物学分析鉴定为科氏芽孢杆菌(Bacillus cohnii)。粗酶性质研究显示,该菌株所产β-甘露聚糖酶最适作用温度和pH分别在55℃和9. 5。通过单因素和正交设计试验优化后,该菌株摇瓶发酵至36 h时,产酶水平为345 U/L,是优化前产酶水平的4. 3倍。研究结果为碱性β-甘露聚糖酶的放大发酵奠定了基础,为碱性β-甘露聚糖酶编码基因的克隆及异源表达等相关研究提供了良好的菌种资源。     

玉米谷氨酰胺酶基因在毕赤酵母中表达条件的优化

为确定玉米谷氨酰胺转氨酶基因在毕赤酵母中的最佳诱导表达条件,将构建好的重组表达载体pPIC9K-TGZ经Sac I线性化处理,电转入巴斯德毕赤酵母GS115,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,聚合酶链式反应扩增验证,甲醇诱导表达。通过正交试验确定工程菌最佳表达条件:表达培养基BMMY,诱导表达时间96 h,初始表达pH值6.0,菌体起始诱导OD600nm值4.0,诱导温度24 ℃,甲醇添加量0.6%(体积分数)、甲醇流加时间间隔12 h/次,诱导48 h后每24 h添加1 g/L甘油。采用优化的条件得到培养基上清的最高酶活达7.51 U/mL。     

产β-甘露聚糖酶菌株的筛选鉴定及产酶条件优化

为获得产β-甘露聚糖酶菌株,取常年种植魔芋的土壤,通过富集培养与筛选鉴定获得目标菌株,并对其产酶条件进行优化。结果表明,分离到6株可以降解魔芋粉的菌株,其中菌株HKS018产生的降解圈最明显,且酶活最高。对菌株HKS018的16S rDNA基因序列和gyrB基因序列进行扩增,通过序列比对及构建系统发育树,结合形态特征、生理生化特征鉴定菌株HKS018为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。其最优发酵条件为：发酵温度30 ℃、发酵时间48 h、初始pH值为7.0、接种量1.0%、装液量50 mL/250 mL、转速180 r/min。在此优化条件下,β-甘露聚糖酶酶活为68.28 U/mL,比优化前酶活力提高了5.29倍。     

新型GH5家族β-甘露聚糖酶的基因挖掘及表达鉴定

为了获得性能优良的新型β-甘露聚糖酶,本研究采用基因挖掘技术从米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40基因组中挖掘到了2个假定的新型GH5家族β-甘露聚糖酶基因,分别命名为Aoman5A和Aoman5B。对这两条序列做了相关的生物信息学分析,同时借助p PIC9KM质粒将两个酶的成熟肽编码基因在Pichia pastoris GS115中实现了表达,并对表达产物进行了纯化和鉴定。生物信息学分析的结果表明Ao Man5A含有20个氨基酸残基的信号肽,而Ao Man5B含有21个氨基酸残基的信号肽和12个氨基酸残基的前导肽;序列比对的结果显示两个酶与目前已报道的序列最高的同源性分别为68%和79%,且Ao Man5A的N端还携带有一个1家族的CBM;三维结构预测的结果显示,两者均符合(α/β)8的TIM-桶状结构。表达鉴定的结果表明,在同样表达条件下,re Ao Man5A和re Ao Man5B上清液的酶活力分别为2.9、12.5 IU/m L;纯化后它们的酶比活力分别为8.3、104.2 IU/mg,前者的最适温度为35℃,而后者的最适温度为50℃,p H值特性的测定结果表明这两种酶均为酸性酶。硫酸-苯酚法测得re Ao Man5A和re Ao Man5B的糖含量分别为25.4%和12.6%,表明这两种重组酶均经过了糖基化修饰。本研究获得了两种新型的β-甘露聚糖酶,比较分析了它们的序列特征,并实现了它们的异源表达,为β-甘露聚糖酶的进一步研究及应用奠定了坚实的基础,也为其他新型酶的基因挖掘提供了可资借鉴的经验。     

毕赤酵母不同甲醇利用表型Mut~+和Mut~s表达FsGLUm基因的比较

将来源于产琥珀酸丝状杆菌的β-葡聚糖酶基因根据毕赤酵母的偏好性进行密码子优化,通过全基因合成该优化基因(Fs GLUm)并构建重组表达载体p PIC9K-Fs GLUm。将p PIC9K-Fs GLUm分别用SalⅠ和BglⅡ酶切线性化后电击转化入毕赤酵母GS115染色体DNA中,经过表型筛选和抗性筛选获得不同甲醇利用表型Mut+和Muts阳性菌株。经刚果红平板检测,在摇瓶水平下,Mut+型菌株表达产物产生的水解透明圈明显大于Muts型菌株表达产物。在发酵罐水平下,Mut+型菌株各时间段表达产物酶活性明显高于Muts型菌株。Mut+型菌株表达的酶活性在甲醇诱导96h达到最大值,为6424U/m L,比活性为2607U/mg,菌体干重为123.6g/L。Muts型菌株表达的酶活性在诱导后108h达到最大值,为119U/m L,比活性为1867U/mg,菌体干重为113.5g/L。以上结果表明,Mut+型毕赤酵母更有利于产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的表达。     

耐高温β-甘露聚糖酶基因的高效表达与水解魔芋精粉条件的优化

β-1,4-D-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)能够随机催化水解甘露聚糖和葡甘露聚糖等中的β-1,4-甘露聚糖苷键。魔芋(Amorphophallus konjac)精粉是葡甘露聚糖类物质,以之为原粉在甘露聚糖酶的作用下可制作益生元类低聚甘露糖。采用串联多拷贝表达盒的方式提高耐高温甘露聚糖酶的表达量,获得具有高产特性的菌株;探究甘露聚糖酶的酶学性质以及水解魔芋精粉制作低聚甘露糖的最适条件,为甘露聚糖酶的产业化及低聚甘露糖的酶法制备奠定基础。结果表明:该酶的最适温度为70℃,最适p H5.0;所获得的多拷贝菌株在14 L发酵罐下酶活可达10810 U/m L;在最适反应条件下,该酶可高效地将魔芋精粉水解为低聚甘露糖。     

异甘露聚糖酶生产菌的诱变育种及固态发酵条件的优化

为了提高异甘露聚糖酶活性,对实验室保藏的一株分泌异甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌K-6(Bacillus subtilis K-6)进行紫外诱变育种,并优化一株正突变株的固态发酵条件。出发菌株枯草芽孢杆菌K-6的酶活力为206.0U/mL,经紫外线诱变处理后,挑选在培养基上透明水解圈较大的菌株进一步复筛,获得枯草芽孢杆菌K-6-9高产突变株,酶活力为349.3U/mL,高于出发菌株69.6%。连续5代发酵,K-6-9的酶活力范围为343.0～350.3U/mL,表明该突变菌株产酶性能稳定。以K-6-9为菌种,采用单因素试验和正交试验进行最佳固态发酵产酶条件的优化,结果表明：该突变株的固态发酵适宜发酵条件为：发酵时间72h、接种量3%、初始pH 7.5、装料量25g/250mL;培养基组成为：酵母细胞壁添加量8%、料液比1:1.2、麸皮添加量40%,此优化条件下固态发酵K-6-9菌株产酶酶活力最高达601.6U/mL。     

耐热β-甘露聚糖酶基因的克隆与表达及酶学性质

基于生物信息学和基因组学分析的结果,采用RT-PCR技术从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001中克隆出一种糖苷水解酶(GH)26家族β-甘露聚糖酶(AuMan26A)成熟肽编码基因(Auman26A),成功实现其在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的异源表达。重组β-甘露聚糖酶(reAuMan26A)的发酵上清液对角豆胶的酶活性为281.9 U/mL,纯化后比酶活为2281.7 U/mg。其最适反应温度Topt为40℃;在80℃处理60 min后残留酶活性为60%;90℃时的半衰期t1/290为10 min,处理60 min后残留酶活性仍为33%;其最适pH为5.5,在pH 5.0~7.0的范围内较稳定;Fe2+和Fe3+对其有明显的抑制作用,其它所测金属离子和EDTA对其没有明显的影响;所测酶的最适底物为角豆胶,其次是魔芋粉和瓜尔豆胶,其对角豆胶的Km和Vmax值分别为15.25 mg/mL和7 841.9 U/mg。reAuMan26A良好的热稳定性使其在食品、饲料和纺织等工业具有广阔的应用前景。