口蹄疫病毒二价DNA疫苗的构建及实验免疫研究

通过PCR方法从本室已构建的克隆载体pGEMT-P1-2A获得O型口蹄疫病毒主要保护性抗原VP1基因,以基因突变获得A型VP1基因。将这两种血清型的VP1基因串联后连接到真核表达载体PVAX1 PCMV启动子下游,构建成口蹄疫二价核酸疫苗pVAX1-OA。经Western blot和IFA检测,目的蛋白在HeLa细胞中获得正确表达。动物实验表明,免疫小鼠T淋巴细胞明显增殖,特异性CTL杀伤活性较对照组显著提高;血清抗体能分别与O型和A型抗原反应,抗体效价均高于空白对照组,但较灭活苗低。     

基因枪轰击小鹅瘟病毒VP3基因疫苗诱导鹅体内体液免疫的机制

将小鹅瘟病毒VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)分别以每只1μg、3μg和6μg的基因枪轰击免疫30日龄四川白鹅,用免疫组织化学法检测pcDNA-GPV-VP3在鹅体内各组织器官表达情况;用间接ELISA检测免疫鹅血清中GPV抗体滴度.结果:①各剂量免疫组1d时能在免疫部位皮肤,3d时能在心脏/十二指肠/空肠/盲肠/肝脏,7d时在回肠/直肠检测到pcDNA-GPV-VP3的表达;7d表达最多;表达可持续至35～63d;表达产物的数量和表达持续时间总体规律为6μg组＞3μg组＞1μg组.②免疫后第7d血清抗体开始升高,21d达到最大值,免疫后第14～217d极显著(P<0.01)高于PBS和空白质粒对照;体液免疫效果存在一定的剂量依赖.研究表明,pcDNA-GPV-VP3基因枪轰击免疫雏鹅后能在免疫部位皮肤、心肌、肝脏和各肠段中表达并能够诱导雏鹅产生良好的体液免疫.     

结核分枝杆菌DNA疫苗的免疫原性和保护效率的比较研究

对结核分枝杆菌两种DNA单价疫苗的免疫应答和保护效果进行了评价和比较。将结核分枝杆菌抗原蛋白。MPT70(22kDa)和PstS-3(40kDa)克隆到原核表达载体pET22b中,酶切和测序鉴定正确后转化入E．coli BL21(DE3)PLysS宿主菌株内中,通过诱导表达纯化获得目的蛋白用于DNA疫苗效价鉴定。用真核表达载体pJW4303构建了MPT70,PstS-3(包括信号肽的全基因)两种重组真核质粒(DNA疫苗),进行了酶切鉴定和序列分析,确定含有正确的读码框。用上述DNA疫苗分别肌注免疫小鼠,三免小鼠后21天MPT70和PstS-3抗体均达到为1：12800,三免后21天小鼠的脾脏细胞诱导产生较高水平的MPT70和PstS-3特异性的细胞因子γ-干扰素,浓度分别为16872．82pg／ml和11460．98pg／ml.三次免疫后经静脉强毒攻击,两组DNA疫苗免疫鼠的肺脏和脾脏的载菌数均比阴性对照组少,表明这两种疫苗都能诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答,而且以前者为主。综合各项指标发现,DNA疫苗MPT70要优于PstS-3。     

PPV VP2和PCV2 ORF2重组病毒样颗粒的获得及其免疫原性研究

将PCV2 ORF2基因插入PPV VP2基因HindⅢ酶切位点(即PPV VLPs的N端1/3处)获得重组基因VP2.ORF2,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-C1中得到重组质粒pEGFP-VP2.ORF2,经转染及电镜观察表明成功获得VP2.ORF2重组病毒样颗粒。重组病毒样颗粒经超速离心纯化后免疫小鼠,同时设立PPV普通疫苗、PCV2弱毒株及空白对照组,并在不同时期检测小鼠CD_3~+、CD_4~+、CD_8~+T淋巴细胞动态变化情况及PPV和PCV2抗体水平。结果显示:VP2.ORF2重组病毒样颗粒免疫小鼠后能诱导较高水平的细胞免疫和高于同等条件普通疫苗和弱毒株的体液免疫水平。此研究结果为进一步探索VP2.ORF2重组病毒样颗粒的形成机制提供了依据,也为PPV-PCV2二联疫苗的研发打下了基础。     

脂质体包裹猪白细胞介素6基因对猪带绦虫抗原基因免疫小鼠的影响

比较研究了BALb/c小鼠分别肌肉注射猪带绦虫抗原基因VTS76、猪白细胞介素6（VPIL－6）联合VTS76及其阳离子脂质体包裹质粒等5个处理的免疫效应。结果表明，VTS76联合VPIL－6共注射小鼠的IgG含量和抗体滴度，脾细胞增殖反应和IL－2诱生活性以及免疫细胞数量，均比注射VTS76的显著增强。经阳离子脂质体包裹的VTS76＋VPIL－6在减少质粒用量80％时，免疫应答水平仍显著高于脂质体包裹VTS76，且明显高于VTS76＋VPIL－6，证明VPIL－6能显著增强基因疫苗（VTS76）免疫小鼠的免疫应答。     

铜绿微囊藻生物钟蛋白的表达纯化与抗体制备

为了获得融合表达的铜绿微囊藻(Microcystic aeruginosa)生物钟蛋白KaiA、KaiB、KaiC并制备其相应的多克隆抗体,将kaiA、kaiB、kaiC基因分别克隆到原核表达质粒pET-His中.重组质粒pET-His-KaiA,pET-His-KaiB和pET-His-KaiC经酶切和测序鉴定后,分别转化E.coli BL21(DE3)进行融合表达.经SDS-PAGE分析可知,融合表达的KaiA、KaiB和KaiC蛋白表达量可分别达到菌体总蛋白的25%、40%和20%.经亲和层析后融合蛋白KaiA和KaiB的纯度分别达95%和92%,而KaiC经胶回收纯化后纯度也可达93%.将纯化后的三种Kai蛋白作为抗原分别免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA检测抗体滴度表明,制备的抗KaiA、抗KaiB和抗KaiC的多克隆抗体效价高,分别可达到1:50000、1:60000和1:100000.Western blotting结果表明:获得的多克隆抗体具有较高的效价,抗体能识别相应的Kai蛋白,具有较高的特异性,能用于铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiA、KaiB和KaiC的表达节律检测.     

鳗弧菌油乳化二价口服疫苗免疫养殖大菱鲆的免疫应答及免疫效果的研究

以鳗弧菌M3和SMP1为细菌抗原制备了油乳化二价疫苗,用饵料包埋后连续7天口服免疫大菱鲆鱼,评价鱼的免疫应答和疫苗的保护效果.结果显示,乳化疫苗在鱼后肠刺激产生的溶菌酶和抗蛋白酶活性以及抗体水平均高于未乳化疫苗(P＜0.05);并且在乳化疫苗免疫的鱼血清检测到明显升高的M3抗体效价(P＜0.05).原位杂交结果显示,乳化疫苗免疫鱼的后肠IgM的产生水平高于未乳化疫苗免疫鱼.攻毒实验显示,乳化疫苗免疫的鱼对M3和SMP1的感染分别获得100%和50%的免疫保护率,而未乳化疫苗获得的免疫保护率分别为57.9%和0%.结果表明,鳗弧菌油乳化二价口服疫苗能引起大菱鲆后肠的非特异性和特异性免疫应答并有效地抵抗鳗弧菌的感染,适合用作水产口服鱼用疫苗.     

重组治疗性乙型肝炎疫苗（YIC）的实验研究

研制了抗原-抗体复合物型乙肝治疗性疫苗。用小鼠实验证明这一治疗性疫苗的作用机理为：通过复合物中抗体Fc段与抗原呈递细胞表面的Fc受体结合,促进了细胞摄取抗原。复合物中的抗原经呈递后可比单纯抗原更有效地激活T细胞增殖,释放更多的γ-干扰素和白细胞介素-2,属TH1类型应答。复合物可在小鼠中诱生较单纯抗原诱生的抗-HBs高10倍以上。复合物还可诱生更强的细胞免疫,表现为经特异的抗原刺激后,γ-干扰素的mRNA量增多。还发现复合物可在对HBsAg低应答鼠系中（B 10.S）诱生与正常应答鼠相当的抗体效价。在HBsAg阳性转基因鼠中,复合物可使部分鼠的HBsAg转为阴性,并可产生抗-HBs,反映这一疫苗具有疗效。为制备人用乙肝治疗性疫苗建立了用重组酵母菌表达的HBsAg与人高效价抗乙肝免疫球蛋白组建治疗性疫苗的工艺,以及产品标化及效力的参比实验技术。     

植物抗体基因工程：II．马铃薯Y病毒中和抗体cDNA基因文库的构建及含抗体轻链和重链基因阳性克隆的筛选

从大量繁殖的Ｄ７３杂交瘤细胞中提取制备其基因组ｍＲＮＡ，并以此为模板，经反转录途径获得基因组ｃＤＮＡ，随后将其插入到λｇｔ１１中，构建了马铃薯Ｙ病毒小鼠单克隆抗体ｃＤＮＡ基因文库。经免疫原位杂交，从该基因文库中筛选出３０个含抗体轻链基因和１０个含抗体重链基因的阳性克隆，进一步将其插入到ｎＧＥＭ－７Ｚ（＋）质粒中，经酶切分析和电泳检测，证实在获得的轻链和重链阳性克隆中各有一个质粒（Ｋ６和Ｇ９）具有较长的外源ＤＮＡ插入（分别为１Ｋｂ和１．６Ｋｂ），它们可能编码完整的抗体轻链和重链蛋白。     

鳗弧菌灭活疫苗对海水养殖大菱鲆的免疫预防研究

福尔马林灭活的鳗弧菌疫苗分别以浸泡、注射接种的方式对海水养殖大菱鲆鱼苗进行免疫 ,定期检测血清中特异性抗体。 4周后用鳗弧菌悬液 (3.7× 1 0 8cfu/ml) 0 .2ml腹腔注射感染免疫鱼。结果表明 ,灭活鳗弧菌疫苗用 2种方式免疫后都能刺激大菱鲜产生特异性免疫反应。其中注射免疫组在 1周后即可产生特异抗体 ,在 6周内一直呈上升趋势 ,最高达 1 2 2 8.8,免疫 4周后人工感染后的免疫保护力为 91 .70 %。浸泡免疫组在 3周后才产生抗体凝集价 ,凝集抗体效价最高 36 ,免疫保护力为 33.30 %。     

酵母人工染色体载体的改造和修饰

将能在植物中表达的烟草花叶病毒ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、ＧＵＳ基因、潮霉素（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）基因及ＭＯＳ终止子组建到酵母人工染色体（ＹＡＣ）载体，构建了具有能在植物细胞中表达和选择ｐＹＡＶ、ＧＵＳ、ｐＪＳ９７／ｐＪＳ９８－ＨＹ ＹＡＣ载体系体系统和一个标记ＹＡＣ克隆的ｐＵＲ４３－ＨＹ质粒。     

联合应用凋亡素基因、新城疫病毒HN基因及IL-18基因对黑色素瘤的抑制效应研究

以前的研究结果表明,来自于鸡贫血病毒的凋亡素基因、来自于鸡新城疫病毒的HN基因和IL-18基因具有不同的抗肿瘤效应,但上述基因抗肿瘤的机制不同,本研究在双启动子真核表达质粒pIRES中的CMV启动子下游插入凋亡素基因,IRES启动子下游插入IL-18HN嵌合基因,构建能同时表达三种基因的真核表达质粒pIRVP3IL-18HN。复制C57BL／6小鼠荷黑色素瘤模型,并将质脂体包裹的重组质粒进行瘤内注射,共注射3次,每次100μg质粒,拟观察凋亡素、新城疫病毒HN基因和IL-18基因以核酸疫苗的形式联合应用对小鼠黑色素瘤的抑制效应。结果显示pVIL-18HN、pVlL-18和pVVP3IL-18均有抑制肿瘤作用,但pIRVP3IL-18HN组抑瘤率高于pVIL-18HN组、pVIL-18VP3组、pVIL-18组和Hanks液对照组。研究结果提示,上述3种基因联合应用具有协同抑瘤效应。     

人类遗传病的家系收集疾病基因定位克隆与疾病基因功能的研究

介绍了中国医学遗传学国家重点实验室在遗传病家系收集、疾病基因定位、疾病基因克隆和疾病基因功能研究方面的研究工作。用细胞遗传学G显带技术于1975年发现了一条与鼻咽癌相关的标记染色体t(1:3)(q44;p11);1981年将睾丸决定基因（TDF）定位于Yp11.32带;1991年以来收集遗传病家系345种共590个;1996年用显微切割、PCR、微克隆技术克隆了EXT2基因;1998年用基因家族－侯选疾病基因克隆方法克隆了遗传性神经性耳龙聋基因GJB3;1999年用连锁分析和全基因组扫描将一种遗传性弥漫性浅表性光敏性汗孔角化症定位于12q23.2带,并在基因功能研究中发现了一个新的细胞内转运蛋白。     

壳聚糖/基因传递系统的制备及性能

利用壳聚糖制备了不同N/P(氮/磷)物质的量比的壳聚糖/基因传递系统。通过凝胶电泳、激光粒度分析和原子力显微分析技术研究了壳聚糖分子量、N/P物质的量比对传递系统结合性能、平均粒径、Zeta-电位和颗粒形貌的影响;通过体外模拟考察了传递系统的抗消化的能力和控释行为。结果显示,壳聚糖分子量越大、N/P物质的量比越大,对基因的保护能力越强,形成的传递系统在模拟环境中越稳定,抗DNaseⅠ和溶菌酶消化的能力越强。pH值的降低使壳聚糖显示出"质子海绵"效应,pH值增大使传递系统结构松散,导致基因的释放。     

极大节旋藻(Arthrospira maxima)生物钟基因kaiC的克隆及分析

以kaiC基因簇部分已知序列为引物设计位点,采用PCR反应池法从节旋藻基因组fosmid文库中筛选到kaiC基因克隆,通过步移测序获得了kaiC基因全长序列。kaiC基因编码区长1554bo,基因GC碱基含量平均为41．76％,密码子第三位明显偏向于U。在基因上游385bp范围内发现一个可能的启动子序列和一些基因调控元件。KaiC蛋白分析发现了Walker A、DXXG、不完整的Walker B等重要模体和具有催化作用的功能位点。Southem杂交的结果证明kaiC基因在极大节旋藻中为单拷贝。极大节旋藻kaiC基因的特殊结构特征为研究kai基因簇的进化提供了重要的启示。     

Systematic Engineering of Uniform,Highly Efficient,Targeted and Shielded Viral‐Mimetic Nanoparticles

In the past decades, numerous types of nanomedicines have been developed for the efficient and safe delivery of nucleic acid‐based drugs for cancer therapy. Given that the destination sites for nucleic acid‐based drugs are inside cancer cells, delivery systems need to be both targeted and shielded in order to overcome the extracellular and intracellular barriers. One of the major obstacles that has hindered the translation of nanotechnology‐based gene‐delivery systems into the clinic has been the complexity of the design and assembly processes, resulting in non‐uniform nanocarriers with unpredictable surface properties and efficiencies. Consequently, no product has reached the clinic yet. In order to address this shortcoming, a multifunctional targeted biopolymer is genetically engineered in one step, eliminating the need for multiple chemical conjugations. Then, by systematic modulation of the ratios of the targeted recombinant vector to PEGylated peptides of different sizes, a library of targeted–shielded viral‐mimetic nanoparticles (VMNs) with diverse surface properties are assembled. Through the use of physicochemical and biological assays, targeted–shielded VMNs with remarkably high transfection efficiencies (>95%) are screened. In addition, the batch‐to‐batch variability of the assembled targeted–shielded VMNs in terms of uniformity and efficiency is examined and, in both cases, the coefficient of variation is calculated to be below 20%, indicating a highly reproducible and uniform system. These results provide design parameters for engineering uniform, targeted–shielded VMNs with very high cell transfection rates that exhibit the important characteristics for in vivo translation. These design parameters and principles could be used to tailor‐make and assemble targeted–shielded VMNs that could deliver any nucleic acid payload to any mammalian cell type.     

基因表达系列分析的研究进展及应用

简要概括了SAGE的基本原理和实验程序，侧重对该技术的程序修改和完善以及该方法最近在筛选候选新基因方面的应用进行综述报道。     

微生物降解苯酚的研究进展及其工程菌的应用前景

概述了苯酚的生物降解途径和几株降解菌的基因组成及其作用机制，提出了生物降解的调控模式，并讨论了工程降解菌的构 建及应用前景。     

Dopamine-mimetic-coated polyamidoamine-functionalized Fe3O4 nanoparticles for safe and efficient gene delivery

Fe₃O₄ nanoparticles (NPs) are widely used in the construction of drug and gene delivery vectors because of their particular physicochemical properties. Surface modification can not only reduce the cytotoxicity of Fe₃O₄, but also further improve the biocompatibility and delivery efficiency. In this work, firstly, polydopamine (PDA)-coated Fe₃O₄ NPs (named Fe₃O₄@PDA) were prepared by using the self-polymerization characteristics of dopamine in alkaline environment. Then, polyamidoamine (PAMAM) was modified by the Michael addition reaction to prepare water-soluble core‒shell magnetic NPs of Fe₃O₄@PDA@PAMAM, and its potential as gene vector was further evaluated. The results revealed that Fe₃O₄@PDA@PAMAM had the ability to condense and protect DNA, and showed lower cytotoxicity, higher cell uptake and transfection efficiency than those of PAMAM. It has the potential to become a magnetic targeted gene vector for further study.