烟草NtRAX基因的克隆和序列分析

根据GenBank中拟南芥RAX基因序列, 在烟草EST数据库中进行Blastp检索, 获得与之同源性较高的蛋白质序列, 选取同源性最高的蛋白质序列所对应的核酸序列, 设计引物, 获得中间片段, 再运用中间片段设计引物, 应用RACE方法获得其5′和3′末端cDNA序列, 将获得的3段序列拼接, 结合全长克隆测序验证, 获得一个新的普通烟草基因, 将其命名为NtRAX(NCBI登录号为JQ228591)。NtRAX的cDNA全长为1112 bp, 5′端非编码区96 bp, 3′端非编码区62 bp, 编码区长度为954 bp, 编码317个氨基酸, 预测的分子量是35.42 KDa。对该基因进行序列分析和功能预测, 得出该基因属于MYB基因家族, 是具有转录激活活性的烟草腋芽分生组织形成的调控基因。     

西兰花(Brassica oleracea var.italica)硫代葡萄糖苷酶基因 cDNA分子克隆及其特征分析

目的:研究西兰花硫代葡萄糖苷酶(简称硫苷酶)cDNA的结构特征,为硫苷酶异源表达打下基础.方法:以西兰花幼苗为试材.根据同源序列法PCR扩增硫苷酶特异cDNA片段,再用3＇RACE和5＇RACE分别扩增cDNA 3＇端序列和5＇端序列,经序列拼接获得西兰花硫苷酶全长cDNA序列.利用在线蛋白质分析系统对其编码的氨基酸序列进行结构特征分析.在NCBI CDD数据库中查找保守结构域,在SWISS-MODEL上进行在线蛋白同源模建,用MEGA3.1构建NJ系统树.结果:该基因cDNA全长1830bp,含有一个1641bp的ORF及31bp的5＇端非翻译区和158bp的3＇端非翻译区,命名为BoMyr2(GenBank登录号为EU004075);编码氨基酸序列含有20个氨基酸长度的信号肽及9个天冬酰胺N末端糖基化位点,编码的蛋白分子质量(Mw)约为62.2 kD,等电点(pI)为8.71;BoMyT2推测氨基酸序列舍有糖基水解酶家族1特有的糖基水解酶结构域,其编码蛋白与PDB库中白芥硫苷酶有类似的三维结构,具有明显的β/α(TIM)桶结构;BoMyr2应归为硫苷酶基因家族的MB亚族.     

普通烟草WDR基因的克隆与序列分析

在烟草腺毛的发育中,WD40-bHLH-MYB复合体起着重要的调控作用。利用RT-PCR从云烟85中克隆得到一条普通烟草(Nicotiana tobacum)WDR(NtWDR)全长cDNA序列,GeneBank登录号为GQ260131。NtWDR基因cDNA全长1433bp,具有一个1029bp的开放阅读框(ORF)、一个147bp的5′非翻译区和一个257bp的3′非翻译区。该基因编码一个342aa的蛋白质,预测的分子量为38.49kDa,等电点为4.81。BLASTs和NCBI保守域收索表明,NtWDR是AN11/TTG1型WD40蛋白。系统进化和结构特征分析表明,NtWDR基因是PhAN11和Le113964R基因的垂直同源基因。     

圆弧青霉脂肪酶基因序列的生物信息学分析

从圆弧青霉PG37中克隆了碱性脂肪酶(Lip I)基因,并采用生物信息学分析了PG37 Lip I基因携带的遗传信息.序列分析结果表明:Lip I DNA序列全长1 480 bp,不存在重复序列,含有5个内含子,5' 端存在TATA box和多个转录因子结合位点;cDNA序列全长1 128 bp,包含了转录起始位点、5' 和3' 非编码区及858 bp的开放阅读框架;Lip I编码区对TGC、GAC、TTC、CAC、AAG、AAC和TAC这7种密码子使用频率最高;比对Lip I基因与Pichia pastoris基因组中的密码子使用频率,其中有21个密码子使用频率的比值相差较大.     

普通烟草抗渗透胁迫基因NtP5CS的克隆与表达分析

从普通烟草中克隆脯氨酸合成的关键酶基因P5CS,分析其序列特征、进化关系、表达模式,以期为烟草的抗逆研究奠定基础。设计兼并引物获得P5CS基因中间片段,利用RACE技术扩增其全长cDNA;采用生物信息学技术分析该基因的序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用RT-PCR研究其表达模式。从受干旱胁迫诱导的普通烟草品种中烟14中克隆到全长为2584bp的烟草P5CS基因,命名为NtP5CS,GenBank登录号为HM854026,开放读码框为2160 bp,编码719个氨基酸。经Blast同源性比对分析,该序列与番茄tomPRO2基因在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。系统进化树分析显示,NtP5CS与番茄tomPRO2基因可能是直系同源基因。RT-PCR分析表明,干旱、低温、ABA、高盐等胁迫条件均可诱导NtP5CS基因的上调表达,且在旺长期和胁迫条件下根和叶中表达量最高。首次从普通烟草中克隆得到P5CS基因,该基因对水分胁迫响应,可能参与普通烟草抗渗透胁迫反应。     

福寿螺(Ampullaria crossean)mfc 基因的分子克隆和序列分析

目的:从福寿螺胃组织细胞中扩增多功能纤维素酶基因,与pGEM T-easy载体连接,转化大肠杆菌删DH5 a.结果:该基因全长为1 225 bp,上游5'端非翻译区19 bp,3'端非编码区21 bp,开放阅读框(0pen reading frame,ORF)1 185bp,编码395个氨基酸,推测等电点pI为6.57,分子质量45.8k Da.推测的多功能纤维素酶具有糖苷水解酶保守的氨基酸序列,属于糖苷水解酶第10家族.同源性比对结果显示,该基因及推测的氨基酸序列与egx(GenBank Accession No.AAP 31 839)的同源性分别为99.3%和99.8%,在8个位点出现核苷酸差异.在1个位点出现氨基酸差异.通过软件分析并预测,该基因编码的蛋白共存在14个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点.没有信号肽序列.结论:成功克隆出福寿螺多功能纤维素酶基因.     

巴氏杜氏藻ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与分析

ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因是胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶之一。根据实验室已获得的巴氏杜氏藻ZDS基因的cDNA序列,设计引物,通过分段PCR的方法,获得ZDS基因的编码区序列。然后根据获得编码区序列,利用染色体步移的方法获得其两端侧翼序列:启动子和终止子,并利用生物信息学工具对获得序列进行分析。实验获得的完整ZDS基因全长11896 bp,其中编码区序列(从"ATG"到"TAA")长度为6435,编码区上游序列4091 bp(包括33 bp的5’UTR序列),编码区下游序列1370 bp(包括411 bp的3’UTR序列)。将编码序列与cDNA(开放阅读框)进行比对,发现整个编码区序列含有12个外显子和11个内含子,其中内含子长度达4686 bp,约为外显子长度的2.68倍,内含子均以GT开始,AG收尾,属于最常见的内含子类型。通过生物信息学分,发现ZDS启动子中具有多种转录因子结合位点,包括与光调控有关的GAGAbox,ASF1;与植物黄化反应有光的ACGTbox等。     

巴氏杜氏藻八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆与分析

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)类胡萝卜素生物合成途径中的上游关键酶。本研究根据NCBI上已发布的巴氏杜氏藻mRNA序列(GenBank:Y14807),设计特异性引物,通过基因组步移法及半巢式PCR的方法,获得PDS编码区序列。在编码区序列获取过程中,发现5’端编码区有325 bp序列与NCBI上公布的cDNA序列有所不同,故采用了5’RACE技术进行验证,经过比对发现结果与本实验基因组步移所获得序列相匹配,推测NCBI公布mRNA序列的PDS与本实验获取的PDS可能为同工酶。然后根据获得的序列,再利用基因组步移PCR的方法获得其两端侧翼序列:启动子和终止子,并利用生物信息学工具对其进行分析。实验获得的完整PDS基因全长12678 bp,其中编码区序列长度为8113 bp,编码区上游序列3010 bp,编码区下游序列1555 bp,编码区序列含有12个外显子和11个内含子。通过生物信息学分,发现PDS启动子中具有多种转录因子结合位点。     

TMV、PVY福建分离物分子鉴定及末端区域变异分析

为及时准确地鉴定出病毒病原和追踪了解病毒病流行变异趋势,使用特异性引物对福建烟区病毒烟叶样品进行RT-PCR分析,分别鉴定出病毒病原为TMV和PVY.序列测定结果表明PCR扩增产物为预期的TMV 5'末端和PVY 3'末端序列,大小分别为959和646个核苷酸,均包含末端非编码区和部分病毒功能基因蛋白编码区.将所获得的病毒末端序列与国内外报道的主要病毒分离物的同一区域进行比较,分析结果显示TMV 5'端非编码区保守性极强,不同分离物之间部分126 kDa或183 kDa编码蛋白N端编码区表现出一定程度的变异(突变),PVY外壳蛋白编码区与3'末端非编码区变异数量差异不大,变异(突变)均主要为碱基转换,环境自然选择压力对病毒基因组变异(突变)具有一定的影响.     

烟草花叶病毒病的分子鉴定

为了建立烟草病毒病的分子鉴定体系,采用TMV,CMV和PVY3种病毒的检测引物对烟草花叶病样品进行了RT-PCR扩增,并从核酸水平上对病毒基因序列进行了分析。RT-PCR鉴定结果显示,该病害病原为TMV,测序结果显示扩增产物长923bp,序列比对后发现该序列与TMV3个中国分离物的同源性高达97%,序列分析结果表明该段序列位于TMV基因组3'末端,包含部分MP基因、完整CP基因和3'端非编码区。对CP基因进行了系统进化分析,且该序列已成功登陆GenBank。     

烟草橙蛋白基因的克隆与生物信息学分析

为了获得烟草OR(NtOR)基因的全长序列和进一步揭示其在特色烟叶形成中的作用,采用同源克隆法从烟草品种K326中克隆了NtOR的全长cDNA和基因组DNA序列,GenBank登录号为JN379458和JN375578.生物信息学分析表明,NtOR基因组DNA全长5027bp,cDNA为1188 bp,编码317个氨基酸残基.NtOR蛋白具有2个跨膜域、1个信号肽剪切位点、5个糖基化位点和11个磷酸激酶修饰位点,二级结构包含12个α-螺旋和20个β-折叠,亚细胞定位于质膜上.系统进化与BLAST分析表明,NtOR是SlOR和ViOR的垂直同源基因.GENEVESTIGATOR数据库的芯片结果显示,NtOR基因在子叶中的表达量最高,其次是成熟叶片、幼茎和花,其他组织器官的表达相对较弱.     

滇牡丹ω-3脂肪酸脱氢酶基因克隆与功能分析

ω-3脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸亚麻酸生物合成途径的关键酶。依据转录组数据设计特异性引物,使用RT-PCR方法从滇牡丹克隆得到1个FAD3基因的c DNA全长序列,命名为Pd FAD3(Gene Bank登录号为KX289610)。生物信息学分析结果表明Pd FAD3基因片段序列全长2 134 bp,包含完整的c DNA开放阅读框,编码含有450个氨基酸残基的蛋白质;Blast比对结果显示该蛋白质属于FAD蛋白质家族;系统进化树分析结果显示与芍药属芍药组植物芍药亲缘关系较近;该蛋白质属于跨膜蛋白质,亲水性较低;RT-PCR结果显示其在种子中的表达随着种子成熟出现双峰型的表达量变化,与目前所报道的其他物种的FAD3表达情况相似。为进一步研究其调控机理提供理论依据及获得含高不饱和脂肪酸转基因滇牡丹品种奠定理论基础。     

蒜头果中3-酮酯酰-CoA合酶基因克隆与表达分析

以蒜头果(Malania oleifera)为实验材料,基于转录组数据分析,采用RT-PCR方法获得蒜头果3-酮酯酰-CoA合酶(KCS)基因的cDNA序列,命名为MoKCS1,GenBank登录号为MK210592。序列分析显示MoKCS1基因cDNA全长为1 539 bp,编码512个氨基酸,属于KCS家族。序列比对分析显示Mo KCS1拥有KCS家族特有的3个功能保守结构域,与榴莲(Durio zibethinus) KCS的蛋白序列同源性为80. 66%;与已知超长链KCS蛋白进行系统进化分析显示,MoKCS1独立形成一个分支。荧光定量PCR分析表明,MoKCS1在蒜头果果实膨大期的表达量最高,而在叶中几乎不表达。     

盐藻八氢番茄红素脱氢酶cDNA的分离及序列分析

采用5’和3’RACE技术和梯度PCR方法从盐藻中克隆了八氢番茄红素脱氢酶(Pds)全长cDNA,序列分析表明,该cDNA长2198bp,包含1个1752bp的开放阅读框(ORF),编码一段583氨基酸残基的多肽链。氨基酸序列的同源性分析表明,它与高等植物和蓝藻的八氢番茄红素脱氢酶序列一致性高达67%,而与细菌和酵母的序列同源性较差;在N端具有一段转运序列和辅助因子结合结构域,C端则有一胡萝卜素结合域。这些序列特征预示,盐藻Pds与其他绿藻、高等植物和蓝藻中的同源基因一样催化八氢番茄红素发生前2步脱氢反应,并且需要与另一个脱氢酶联合作用合成番茄红素。     

玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达

以粉红黏帚霉菌株总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆得到玉米赤霉烯酮降解酶基因cD-NA序列,插入pPIC9K载体后,转化毕赤酵母。经MD板筛选,得到His+型重组子,进行甲醇诱导表达,并进行了降解玉米赤霉烯酮能力测定。克隆得到的cDNA序列全长795 bp,连续编码编码264个氨基酸;阳性克隆子在甲醇诱导培养3~5 d后,HPLC检测证实,经表达后的酶液能完全降解液体中玉米赤霉烯酮(ZEN)。     

白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶基因PDS3的克隆与序列分析

利用电子克隆技术,从数据库中找到与拟南芥高度同源的油菜EST序列,继而通过RT-PCR和RACE等方法,成功克隆了白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶（类胡萝卜素合成途径中的一个关键限速酶）基因PDS3的cDNA,命名为BrPDS3（GenBank登记号GQ200741）。cDNA序列全长1 940bp,其中包含114bp的5＇前导序列和134bp的3＇不翻译序列,编码区长度为1 692bp,编码63kD的蛋白。序列分析表明,BrPDS3蛋白与其他植物的PDS蛋白具有较高相似性;在系统进化树中,BrPDS3与甘蓝亲缘关系最近。根据全长cDNA序列设计引物,从白菜型油菜青油13号DNA中克隆得到BrPDS3基因的全长DNA,长度为3 911bp,ORF（开放阅读框）1 692bp,含有15个外显子和14个内含子。     

烟草NtSAP5基因克隆及干旱胁迫下的功能鉴定

为研究烟草对干旱胁迫的响应机制,克隆了烟草中锌指蛋白基因NtSAP5并对其在干旱胁迫下的表达量进行了检测。结果表明,该基因全长CDS序列为474 bp,编码的蛋白中含有保守的锌指蛋白结构域,该基因NtSAP5的表达受干旱胁迫调控,在干旱胁迫下表达量先升高,后缓慢降低。将NtSAP5的CDS序列克隆到植物过表达载体pG2BW7中,并通过叶盘法转入烟草K326中进行干旱胁迫下的功能验证。选取两个独立的转基因株系及非转基因植株进行干旱胁迫处理,过表达NtSAP5的转基因植株比非转基因植株具有较强的抵御干旱胁迫能力。结果表明,烟草NtSPA5响应干旱胁迫,并在干旱胁迫应答中起到作用。      

编码草菇中性内切葡聚糖酶Ⅰ的基因克隆与表达研究

采用RT-PCR法,以草菇Volvariella.volvacea V23总RNA为模板,克隆了包括自身信号肽在内的中性内切葡聚糖酶Ⅰ基因(egⅠ)的cDNA序列。测序结果表明,它全长1167 bp,编码389个氨基酸,推测第1～23位氨基酸为信号肽,第24～389位氨基酸为成熟肽,属于糖苷水解酶第5家族。PCR扩增成熟肽编码基因并将其插入到分泌型表达载体pPIC9K中,重组载体经SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,筛选得到了1株高产中性内切葡聚糖酶Ⅰ的工程菌株P.pastoris-EGⅠ1。SDS-PAGE检测表明,重组中性内切葡聚糖酶Ⅰ分子质量约为42 ku。在甲醇诱导96h时,酶活达到3 698 U/mL。