GASA基因超家族新成员——烟草抗菌肽基因的克隆及序列分析

抗菌肽可以增强植物对病原微生物的抵抗能力,本研究利用生物信息学方法,获得了烟草品种K326的3种抗菌肽cDNA序列(NtSN1a、NtSN16和NtSN2a),并对其进行了序列分析.结果表明,3种抗茵肽cDNA序列均具有完整的开放读码框,NtSNIa和NtSNIb均编码88个氨基酸,NtSN2a编码104个氨基酸.对推导的氨基酸序列分析发现,它们都具有典型的GASA基因超家族保守结构域,属于GASA基因超家族成员.系统进化分析表明,NtSN1a和NtSN16与马铃薯抗菌肽snaking-1聚为一类,NtSN2a与马铃薯抗菌肽snaking-2聚为一类.这些结果为进一步研究抗菌肽基因的抑菌效应,比较其在烟草抗病防御反应中的作用奠定了基础.     

三个烟草防御素基因的克隆及序列分析

为从烟草中克隆与植物抗病虫反应相关的防御素基因, 以辣椒防御素基因为探针, 通过电子克隆的方法从烟草栽培品种K326中克隆到3个防御素基因(NtDEF1、NtDEF2和NtDEF3), 并对其进行了序列分析。结果表明, 3个防御素cDNA序列均包含完整的开放读码框, 分别编码78、77、76个氨基酸, 具有8个半胱氨酸的高度保守结构等典型的植物防御素特征, 成熟肽含有γ-硫素蛋白功能结构域。通过同源比对和进化分析发现, NtDEF1、NtDEF2和NtDEF3的氨基酸序列与辣椒的一致性最高为50%~87%, 亲缘关系较近;但与已报道的烟草属植物防御素的一致性仅为33%~40%, 亲缘关系较远, 表明NtDEF1、NtDEF2和NtDEF3是烟草中未报道的3个防御素基因。     

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为有效调控烟草类胡萝卜素的合成代谢,从普通烟草中克隆到与植物类胡萝卜素合成代谢相关的β-胡萝卜素羟化酶基因BCH,以辣椒BCH基因为探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码BCH基因的cDNA序列,暂命名为NtBCH1(GenBank登录号JQ410446)。NtBCH1包含一个完整的开放阅读框,编码309个氨基酸,具备脂肪酸羟化酶超家族保守结构域。序列比对结果表明,NtBCH1蛋白与其他植物的BCH蛋白具有很高的相似性。系统进化树分析表明,NtBCH1与番茄的亲缘关系最近。     

烟草NtRAX基因的克隆和序列分析

根据GenBank中拟南芥RAX基因序列, 在烟草EST数据库中进行Blastp检索, 获得与之同源性较高的蛋白质序列, 选取同源性最高的蛋白质序列所对应的核酸序列, 设计引物, 获得中间片段, 再运用中间片段设计引物, 应用RACE方法获得其5′和3′末端cDNA序列, 将获得的3段序列拼接, 结合全长克隆测序验证, 获得一个新的普通烟草基因, 将其命名为NtRAX(NCBI登录号为JQ228591)。NtRAX的cDNA全长为1112 bp, 5′端非编码区96 bp, 3′端非编码区62 bp, 编码区长度为954 bp, 编码317个氨基酸, 预测的分子量是35.42 KDa。对该基因进行序列分析和功能预测, 得出该基因属于MYB基因家族, 是具有转录激活活性的烟草腋芽分生组织形成的调控基因。     

烟草类胡萝卜素双加氧裂解酶基因的克隆与序列分析

为揭示类胡萝卜素双加氧裂解酶基因(CCDs)在烟草生长发育过程中的功能,通过RT-PCR技术克隆到烟草的类胡萝卜素双加氧裂解酶4基因(NtCCD4),编码区1806 bp,编码601个氨基酸,基因序列提交NCBI,GenBank登录号为JF947192.根据氨基酸组成对NtCCD4基因编码蛋白的疏水性/亲水性、蛋白结构及进化关系等进行预测和分析.结果表明:烟草NtCCD4基因编码的蛋白分子量为65936.3 Da,等电点为6.58,定位在叶绿体膜上,为一个稳定的亲水性蛋白;二级结构预测显示此蛋白结构以无规则卷曲(57.4％)为主,α螺旋(13.31％)和β转角(6.61％)所占比例相对较少;进化分析表明NtCCD4是类胡萝卜素双加氧裂解酶基因( CCDs)家族中的一个成员,与其他物种的CCD4蛋白比较显示NtCCD4编码的蛋白含有多个保守区域,其中4个组氨酸残基是组成蛋白功能域所必须的,它们与Fe2+结合共同组成蛋白酶的活性中心.     

烟草NCED3 基因的克隆及其干旱胁迫表达分析

为揭示9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED) 在烟草生长发育过程中的功能,通过同源克隆方法获得烟草品种K326 类胡萝卜素降解关键基因NCED3 两个cDNA 全长序列。序列分析表明:K326 NCED3-1 和NCED3-2 基因分别包含一个1842bp 和1830bp 的开放读码框(ORF), 各编码613 个和609 个氨基酸。预测蛋白质分子量分别为68177.8 Da 和67754.2Da,理论等电点(pI) 各为7.66 和7.28。跨膜区预测、亲水性和信号肽分析表明很可能是定位于线粒体膜上的亲水性跨膜蛋白。二级结构预测模型显示此蛋白结构以β 折叠和无规则卷曲为主。蛋白三级结构预测分析表明NCED3-1 与NCED3-2 空间结构极为相似。PEG6000 胁迫分析表明,干旱胁迫可以诱导NCED3 基因表达以及内源ABA 的积累。且在处理12h 之前,NCED3 表达与ABA 累积速度均呈现升高趋势,之后逐渐降低。研究结果为解析NCED3 在烟草抗旱方面的功能提供一定的研究基础。      

烟草CONSTANS同源基因的克隆与分析

日照长度影响植物的生长发育,在拟南芥中CONSTANS是植物光周期开花途径中的关键基因。利用同源序列法结合RACE 技术从短日照烟草品种Kutsaga.Mammoth10 中分离出了开花时间相关的CO(CONSTANS)同源基因,并命名为NtCO1(基因登录号JN022535.1)。经序列分析,NtCO1 全长1493 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,81~1292 bp),编码403 个氨基酸;具有CO 蛋白典型的结构域;氨基末端有两个B-box 结构,羧基末端有CCT 保守结构域。氨基酸同源性比对发现,NtCO1 与茄科CO 同源蛋白一致性最高,同马铃薯CO 序列一致性达到86.5%;与拟南芥CO 蛋白和水稻Hd1 氨基酸序列一致性也分别达到50%和43.7%。基因表达分析表明,NtCO1在叶片中优势表达,茎中次之,根中最弱     

福寿螺(Ampullaria crossean)mfc 基因的分子克隆和序列分析

目的:从福寿螺胃组织细胞中扩增多功能纤维素酶基因,与pGEM T-easy载体连接,转化大肠杆菌删DH5 a.结果:该基因全长为1 225 bp,上游5'端非翻译区19 bp,3'端非编码区21 bp,开放阅读框(0pen reading frame,ORF)1 185bp,编码395个氨基酸,推测等电点pI为6.57,分子质量45.8k Da.推测的多功能纤维素酶具有糖苷水解酶保守的氨基酸序列,属于糖苷水解酶第10家族.同源性比对结果显示,该基因及推测的氨基酸序列与egx(GenBank Accession No.AAP 31 839)的同源性分别为99.3%和99.8%,在8个位点出现核苷酸差异.在1个位点出现氨基酸差异.通过软件分析并预测,该基因编码的蛋白共存在14个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点.没有信号肽序列.结论:成功克隆出福寿螺多功能纤维素酶基因.     

烟草绿原酸合成关键基因NtHQT1的克隆及表达分析

绿原酸(Chlorogenic acid,CGA)是烟叶中含量最高的多酚类物质,羟基肉桂酰辅酶A奎尼羟基肉桂转移酶(Hydroxycinnamoyl-Co A quinate hydroxycinnamoyl transferase,HQT)是植物绿原酸合成代谢途径中的关键酶。为研究HQT基因在烟草绿原酸合成中的作用机制,通过同源克隆技术从烟草中克隆到一个新的HQT基因,命名为Nt HQT1。生物信息学和激素处理后基因表达模式分析结果表明:Nt HQT1 c DNA全长1 305 bp,编码435个氨基酸,Nt HQT1定位在细胞质中,属于疏水性蛋白,其二级结构主要是螺旋和无规则卷曲;茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,Me JA)、生长素(3-Indoleacetic acid,IAA)、独角金内酯类似物(GR24)、细胞分裂素(6-Benzylaminopurin,6-BA)和赤霉素(Gibberellic acid,GA)能明显上调Nt HQT1基因的表达,脱落酸(Abscisic acid,ABA)对基因表达没有明显作用,预示Nt HQT1基因在烟草生长发育和抗病等生物学过程中发挥重要作用。      

嗜热链球菌胸苷酸合成酶基因的克隆与序列分析

本研究以嗜热链球菌(S．thermophilus)染色体DNA为模板,利用PCR技术扩增出胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,thyA)基因,将其克隆入T载体中,转化DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行酶切鉴定,PCR扩增鉴定,进行测序,与已知序列进行同源性比较,结果表明成功克隆了thyA基因,全长900bp,与国外报道的S．thermophilus ATCC19258 thyA基因同源性达99．9%。这为构建以thyA基因为选择压力的非抗生素抗性载体提供了理论依据。     

烟草钾离子通道研究进展

K+通道是烟草吸收K+的重要途径之一.近年来,已从多种植物或同种植物的不同组织器官中分离到多种K+通道基因.笔者从K+通道基因类型、K+通道基因的克隆与功能、K+吸收机制和K+通道分子调控技术等方面综述了烟草K+通道研究现状与进展.对应用生物工程技术改良烟草的钾营养性状进行了讨论,并对利用现代生物技术手段提高烟叶含钾量进行了展望.     

大黄鱼类IV型抗冻蛋白基因的克隆、表达及功能研究

目的 研究大黄鱼类IV型抗冻蛋白基因编码产物的功能.方法 从大黄鱼肝脏SSH cDNA文库筛选到的类似极地鱼类IV型抗冻蛋白的EST序列出发,用RACE方法克隆IV型抗冻蛋白基凶全长cDNA,RT-PCR分析此基因在大黄鱼不同组织内的表达.构建原核表达载体pGEX-4T-Lycarp并表达蛋白质,亲和层析纯化GST融合蛋白,分析它的体外细菌抗冻保护作用.结果 大黄鱼类IV型抗冻蛋白基因cDNA全长664 bp,包含372 bp开放阅读框,编码124个氨基酸,经Signal P 3.0软件预测其N端前20位氨基酸为信号肽,氨基酸序列与长角杜夫鱼IV型抗冻蛋白同源性高达52%:RT-PCR分析表明其mRNA仅在肝脏表达;重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,初步纯化后分析体外细菌抗冻保护作用表明,融合蛋白抗冻活性并不明显.结论 大黄鱼类IV型抗冻蛋白不具有显著的抗冻活性,这与大黄鱼不能在低温下生存吻合.     

西兰花(Brassica oleracea var.italica)硫代葡萄糖苷酶基因 cDNA分子克隆及其特征分析

目的:研究西兰花硫代葡萄糖苷酶(简称硫苷酶)cDNA的结构特征,为硫苷酶异源表达打下基础.方法:以西兰花幼苗为试材.根据同源序列法PCR扩增硫苷酶特异cDNA片段,再用3＇RACE和5＇RACE分别扩增cDNA 3＇端序列和5＇端序列,经序列拼接获得西兰花硫苷酶全长cDNA序列.利用在线蛋白质分析系统对其编码的氨基酸序列进行结构特征分析.在NCBI CDD数据库中查找保守结构域,在SWISS-MODEL上进行在线蛋白同源模建,用MEGA3.1构建NJ系统树.结果:该基因cDNA全长1830bp,含有一个1641bp的ORF及31bp的5＇端非翻译区和158bp的3＇端非翻译区,命名为BoMyr2(GenBank登录号为EU004075);编码氨基酸序列含有20个氨基酸长度的信号肽及9个天冬酰胺N末端糖基化位点,编码的蛋白分子质量(Mw)约为62.2 kD,等电点(pI)为8.71;BoMyT2推测氨基酸序列舍有糖基水解酶家族1特有的糖基水解酶结构域,其编码蛋白与PDB库中白芥硫苷酶有类似的三维结构,具有明显的β/α(TIM)桶结构;BoMyr2应归为硫苷酶基因家族的MB亚族.     

不同种植方式下烤烟根系差异表达蛋白质分析

通过根系差异蛋白质组学探讨了种植方式（复种连作、复种轮作）对烤烟生长的影响。结果表明,共有15个蛋白质表达丰度发生变化,用LC-MS/MS鉴定了14个差异蛋白质点,经生物信息学分析,11个蛋白质的功能有注释,其中3个属于与香气形成有关的蛋白质,包括转酮醇酶、单脱氢抗坏血还原酶和O-甲基转移酶,它们在复种轮作条件下均上调表达,此可能有助于烟叶品质提高,而复种连作处理下调表达,可能不利于品质提高。还鉴定到涉及能量、抗性、物质运输、核酸等功能的蛋白：磷酸甘油酸酯激酶、线粒体内膜移位酶亚基Tim13、NBS-LRR、DnaJ、细胞内囊泡运输蛋白Sly1、核糖体蛋白质,在复种轮作下也上调表达,此可能促进烤烟的生长,有利于提高烟草产量和品质且经济效益较好。而在复种连作处理下调表达,进而可能使得烟草生长变弱、产量降低、品质变差。     

马铃薯α-淀粉酶基因的克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR 方法从马铃薯(Solanum tuberosum)茎段总RNA 中扩增、克隆amyA1 基因(NCBI 登录号GQ406048.1)。采用半定量RT-PCR 方法检测amyA1 基因在马铃薯茎、叶等不同组织中的表达强度,表明在茎组织中的表达丰度略高。利用生物信息学软件分析amyA1 密码子的偏好性;同时对AmyA1 氨基酸的理化性质、细胞内定位、保守结构及高级结构进行预测。基于NCBI 数据库中有物种代表性的29 种α - 淀粉酶基因序列构建了基因进化树。amyA1 基因全长1224bp,可编码一条理论分子质量为46.40kD、407 个氨基酸残基组成的、可能为亲水性的胞外酶。与NCBI已登记的马铃薯α - 淀粉酶基因(登录号M79328.1)核苷酸及氨基酸序列同源性达98%。第20～348 位点范围内的氨基酸残基含有与淀粉酶13 家族及亚家族相似的催化活性域(PF00128、SM00624),第349～407位点范围内的氨基酸残基含有α - 淀粉酶C- 末端β折叠区域(PF07821)。蛋白质结构预测表明氨基酸残基序列有维持淀粉酶活性的(β /α) 8 桶状结构以及其他几个功能域结构。所构建的基因进化树表明,两个马铃薯α - 淀粉酶基因与木薯、苹果的序列同源性较高,与菜豆的次之,与水稻、大麦、玉米等单子叶植物的序列同源性较低。     

普通烟草钙依赖蛋白激酶NtCDPK15的基因克隆及表达分析

钙依赖蛋白激酶(CDPK)对Ca²⁺信号转导通路下游元件的调控具有重要作用。本实验采用同源克隆技术从普通烟草中分离得到1 个CDPK 基因,命名为NtCDPK15(GenBank 登录号为JN662020),cDNA 全长为1963 bp,ORF 大小为1569 bp,编码522 个氨基酸。多序列比对结果表明,NtCDPK15 的编码产物具有典型的CDPK 保守序列,C 末端调控区有4个EF 手性结构。系统进化树分析显示,NtCDPK15 可能来源于绒毛状烟草,预测NtCDPK15 与NtCDPK1这对旁系同源基因在功能上可能非常保守。实时荧光定量PCR 分析结果表明,NtCDPK15 在根和叶中的表达量显著高于茎中的表达量,但经盐胁迫诱导后NtCDPK15 在茎中的表达量显著增加,同时,盐胁迫还使基因在叶中的表达量显著上调,ABA 胁迫可诱导基因在根中的表达,而干旱胁迫可使基因在根和叶中的表达量下调,这些结果说明NtCDPK15 在普通烟草中的表达受盐胁迫及ABA 胁迫诱导,但受干旱胁迫抑制。     

产甘油假丝酵母烯醇化酶基因的克隆及序列分析

从产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)基因文库中分离了一个含烯醇化酶基因(CgENO1)的克隆子.插入片段全长2 456 bp,包含一段1 314 bp的没有内含子的蛋白质编码区,编码一个含438个氨基酸残基的多肽链,其氨基酸序列与来源于酿酒酵母的烯醇化酶相似性为74.3%.多重序列比对显示,产甘油假丝酵母烯醇化酶(CgENO1)含有酵母烯醇化酶全部保守区.对编码区上下游序列分析显示,克隆片段含有典型的酵母基因上下游调控区,是一个完整的酵母新基因.     

普通烟草栽培种内株高性状主基因加多基因遗传分析

以普通烟草栽培种烤烟类型品种分别与香料烟、白肋烟和名优晾晒烟类型品种组配的F1、F2及其亲本为研究对象,利用数量性状主基因+多基因遗传体系分离分析方法分析了3组合4世代株高性状的遗传规律.结果表明,3个组合的株高性状遗传均符合两对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因混合遗传模型(E1),同时均存在加性、显性遗传效应.各主基因和多基因遗传率计算结果,烤烟与晒晾烟、烤烟与香料烟组合的主基因遗传率较高,分别为71.60%和88.55%,可作为烟草株高性状早期世代选择的理论依据.