携带人白细胞介素-1受体拮抗剂基因腺病毒质粒的构建

目的构建携带人白细胞介素-1受体拮抗剂(hIL-1Ra)基因重组腺病毒质粒。方法用EcoRⅤ和HindⅢ双酶切质粒pcDNA3-hIL-1Ra,获得hIL-1RacDNA片段,并定向连接在pShuttle-CMV穿梭载体上,构建穿梭质粒pShuttle-CMV/hIL-IRa。经PmeⅠ酶切线性化,穿梭质粒pShuttle-CMV/hIL-1Ra与超螺旋腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,二质粒在细菌内同源重组,得到重组pAd/hIL-1Ra腺病毒质粒。脂质体介导pAd/hIL-1Ra质粒转染HEK293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒,经反复感染HEK293细胞扩增病毒后,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,并测定病毒颗粒数、纯度及滴度。结果经PCR鉴定、限制性酶切分析及序列测定,证明已正确构建重组pShuttle-CMV/hIL-1Ra穿梭质粒和重组pAd/hIL-1Ra腺病毒质粒。扩增纯化后,重组腺病毒颗粒数为1.19×1011OPU/ml,A260/A280为1.279,滴度为3.6×109CCID50/ml。结论已成功构建重组腺病毒质粒pAd/hIL-1Ra,为hIL-1Ra基因在腺病毒载体介导下的免疫抑制治疗研究奠定实验基础。     

Kozak序列引导的人p53基因重组智能腺病毒载体的构建与表达

目的构建Kozak序列引导的人p53(khp53)基因重组智能腺病毒载体rAdMH-khp53,并检测p53基因的表达。方法将带有Kozak序列的p53基因克隆到重组腺病毒穿梭载体中,再利用AdMaxTMHi-IQ系统,获得重组腺病毒,检测病毒滴度,并进一步感染Saos-2细胞,利用RT-PCR及Western blot检测p53基因的表达。结果khp53基因成功克隆到腺病毒载体中,重组腺病毒滴度为1.63×108IU/ml,RT-PCR方法检测到p53基因的转录产物,Western blot检测到p53基因在Saos-2细胞中的高水平表达。结论已成功构建了带有Kozak序列的重组腺病毒载体rAdMH-khp53,并高效表达人p53基因。     

肠道病毒71型P1和3CD基因双顺反子重组腺病毒的构建及表达

目的构建肠道病毒71型(EV71)P1和3CD基因双顺反子重组腺病毒,并检测3CD蛋白酶的切割作用和表达产物的抗原性。方法采用RT-PCR法从阜阳分离的EV71中扩增P1和3CD基因,构建穿梭质粒pShuttle-CMV-P1-3CD、pShuttle-CMV-P1和pShuttle-CMV-3CD;经同源重组获得重组腺病毒rAd-P1-3CD、rAd-P1和rAd-3CD,分别转染293细胞,RT-PCR法检测目的基因的转录,免疫荧光法检测目的蛋白的表达。结果3种重组腺病毒经PCR和酶切鉴定表明构建正确;RT-PCR检测表明,3个重组腺病毒均已转录目的基因mRNA;免疫荧光检测仅观察到rAd-P1-3CD表达产物具有特异性,而rAd-P1、rAd-3CD未能检测到特异性表达产物。结论已成功构建EV71P1和3CD基因双顺反子重组腺病毒,表达产物具有EV71特异抗原性,提示P1产物只有在被3CD蛋白酶切割后才体现抗原性。     

应用AdMax系统构建携带HCV核心基因Core的重组腺病毒载体

目的应用AdMax系统构建携带丙型肝炎病毒(HCV)核心基因Core的重组腺病毒载体,为进一步研究防止HCV感染的基因疫苗和基因治疗奠定基础。方法RT-PCR法从丙型肝炎患者血清中扩增HCVCore基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-Core,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pAd-Core,经HEK293细胞扩增后,离子交换柱层析法纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度,并计算比活性及单细胞产量。结果重组腺病毒pAd-Core感染的HEK293细胞经PCR检测,可扩增出HCV核心基因Core片段,经测序证明,其插入序列与设计的HCV Core基因序列一致。扩增纯化后,重组腺病毒的比活性达0.034IU/VP,单细胞产量可达2.63×104VP/细胞。结论已成功构建重组腺病毒载体pAd-Core,为Core基因在腺病毒介导下的基因免疫和基因治疗的研究奠定了基础。     

重组腺病毒Ad-PML(NLS)-的构建及鉴定

目的构建携带PML(NLS-)基因的重组腺病毒,并观察其对白血病K562细胞增殖的影响。方法以质粒pCMV-HA-PML(NLS-)为模板,PCR扩增PML(NLS-)基因,与穿梭质粒pAdTrace-TO4连接,构建重组穿梭载体pAdTrace-TO4-PML(NLS-),经PmeⅠ酶切线性化后,转化入感受态BJ5183细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-),经PacⅠ酶切后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,检测其滴度。采用RT-PCR法和Western blot法分别检测重组腺病毒中PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;将重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测其对细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-)经PCR和单酶切鉴定,证明构建正确;经4轮扩增,重组腺病毒的滴度为1×1010pfu/ml;Ad-PML(NLS-)携带的PML(NLS-)能够在AD293细胞中稳定表达;与未感染组和空载病毒感染组相比,重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染的K562细胞的增殖活力明显增强(P<0.05)。结论成功构建了重组腺病毒Ad-PML(NLS-),其可促进K562细胞的增殖,表明PML(NLS-)可能具有促癌基因的作用。     

Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用

大肠杆菌基因敲除技术发展迅速,各种新型技术的出现使得其基因组的改造较以往更为快速、简单,尤其是Red同源重组技术在大肠杆菌基因敲除中的应用已经越来越成熟。综述了几种不同的Red同源重组技术,并分析了每种方法的原理及操作策略,指出了各种方法的特点及优势。     

大鼠活化STAT蛋白抑制剂1基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠活化STAT蛋白抑制剂1(Protein inhibitor of activated STAT1,PIAS1)基因重组腺病毒质粒,并进行鉴定。方法应用RT-PCR法从大鼠胰腺腺泡细胞AR42J细胞株中扩增全长PIAS1基因,经T-A克隆后,亚克隆至穿梭质粒pDC316中,利用同源重组将腺病毒骨架质粒Nad5/F35和穿梭质粒pDC316-PIAS1共转染293细胞,获得重组腺病毒质粒Ad5/F35-PIAS1,经包装和扩增后,获得重组腺病毒。RT-PCR检测PIAS1基因的表达;荧光显微镜观察病毒感染情况;Western blot检测PIAS1蛋白的表达;并计算重组腺病毒的滴度。结果从AR42J细胞中扩增出1 956 bp的PIAS1基因片段,重组腺病毒质粒Ad5/F35-PIAS1经双酶切鉴定证明构建正确。RT-PCR及Western blot分析显示,PIAS1基因和蛋白已在293细胞中表达;荧光显微镜观察显示,重组腺病毒的感染率达90%;病毒滴度为4.45×1010 PFU/ml。结论已成功构建了大鼠PIAS1基因重组腺病毒质粒,为进一步研究PIAS1基因在相关疾病中的作用及其临床应用奠定了基础。     

重组腺病毒载体pAd-4-hMASP-2的构建

目的 利用p Yr-adshuttle-4质粒构建重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2。方法 应用PCR技术扩增甘露糖凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2(human mannan-binding lectin associated serine protease-2,h MASP-2)基因,经Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切后与p Yr-adshuttle-4质粒连接,构建穿梭质粒p Yr-ads-4-h MASP-2,在LR酶作用下与腺病毒骨架载体p Ad/PL-DEST进行体外同源重组,获得重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2,转染HEK293细胞,获得重组腺病毒r Adh MASP-2,应用酶切、PCR扩增及基因测序进行鉴定,并测定病毒滴度。将r Ad-h MASP-2感染小鼠,实时荧光定量PCR法检测h MASP-2基因m RNA在小鼠肺组织中的表达。结果 重组穿梭质粒p Yr-ads-4-h MASP-2经双酶切及测序证实构建正确,通过同源重组获得了重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2,扩增出滴度为1.5×109 PFU/ml的重组腺病毒颗粒r Ad-h MASP-2,其能在小鼠肺组织中表达。结论 成功获得重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2和重组腺病毒颗粒r Ad-h MASP-2,为体内外研究h MASP-2的活性提供了有效的转基因载体。     

人GINS2基因重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的利用AdEasy系统构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,并进行鉴定。方法以pcDNA3.1-GINS2质粒为模板,PCR扩增GINS2基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2,经双酶切及测序鉴定正确的阳性质粒与骨架质粒pAdEasy-1同时转化感受态大肠杆菌BJ5183,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAdE-GINS2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-GINS2,大量扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。Western blot法检测重组腺病毒感染的人HL60细胞中GINS2蛋白的表达,MTT法检测重组腺病毒感染对HL60细胞增殖的影响。结果重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2经双酶切及测序证明构建正确;经酶切鉴定证明重组腺病毒质粒pAdE-GINS2构建正确;经PCR鉴定证明重组腺病毒Ad-GINS2包装成功,经3轮扩增后病毒滴度可达1.35×1012IU/ml;与空载体感染及未感染的HL60细胞相比,重组腺病毒感染的HL60细胞内GINS2蛋白的表达及细胞增殖水平均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,感染人HL60细胞后可促进其增殖,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

Wistar大鼠热休克蛋白70基因重组腺病毒质粒的构建及病毒制备

目的构建Wistar大鼠热休克蛋白(Heat shock protein 70,HSP70)基因重组腺病毒质粒,并制备重组腺病毒。方法利用RT-PCR技术从Wistar大鼠脾脏组织中扩增HSP70基因序列,并克隆至pMD18-T载体中,测序鉴定后,将克隆的HSP70基因编码阅读框亚克隆至穿梭载体pShuttle-CMV中,并利用Ⅰ-CeuⅠ与Ⅰ-SceⅠ将重组穿梭质粒上的HSP70基因的表达框切下,连接到携带腺病毒骨架载体pAdxsi上。重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后,转染至293(R)细胞进行病毒的包装,获得重组腺病毒pAd-CMV-HSP70,收集病毒上清,感染BRL细胞,Western blot检测BRL细胞中HSP70的表达。病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后,检测重组腺病毒纯度、颗粒滴度及感染性滴度。结果克隆质粒、穿梭质粒经PCR及酶切鉴定,均可见2 269 bp的目的基因条带,测序结果与GenBank登录的序列一致;XhoⅠ酶切结果显示,HSP70基因已正确克隆至腺病毒质粒中;重组腺病毒感染BRL细胞后,细胞中HSP70的表达量显著升高(P<0.01);重组腺病毒纯化后纯度为1.29,颗粒滴度为5.31×1012VP/ml,感染性滴度达1×1011pfu/ml。结论已成功构建Wistar大鼠HSP70基因重组腺病毒质粒,并制备出高滴度的重组腺病毒颗粒,为进一步研究HSP70的生物学活性及作用机制奠定了基础。     

人巨细胞病毒糖蛋白gB基因重组腺病毒载体的构建及包装

目的构建携带有人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白gB基因的重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中进行包装。方法将gB基因克隆至穿梭质粒Track-CMV,构建重组质粒Track-CMV/gB,亚克隆至转移载体pAD-Easy-1,构建重组质粒pAD-Easy-1/gB,将该重组骨架质粒转染HEK293细胞,利用HEK293细胞产生重组腺病毒。空斑法及PCR法挑选重组病毒,荧光显微镜观察标志蛋白(绿色荧光蛋白)的表达,利用噬斑法检测病毒滴度。结果重组腺病毒载体经酶切鉴定证明构建正确,转染重组腺病毒载体的HEK293细胞经PCR扩增,可见约700bp的目的基因片段,荧光显微镜观察可见绿色荧光蛋白表达,空斑试验检测病毒滴度为2×106PFU/ml。结论已成功构建了含有gB基因的重组腺病毒载体,为进一步研制重组腺病毒载体HCMV疫苗提供了条件。     

携带人6Ckine/IFNγ融合基因腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建携带人次级淋巴组织趋化因子(6Ckine)和γ-干扰素(IFNγ)融合基因的重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNγ,并在真核细胞中表达。方法RT-PCR法分别从人淋巴结和外周血单个核细胞中扩增人6Ckine cDNA和IFNγ cDNA,分两步先后将6Ckine cDNA和IFNγ cDNA连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,二者之间以XbaⅠ酶切位点相连,应用AdMax腺病毒包装系统在HEK293细胞内同源重组,构建重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNγ,经扩增和纯化后感染真核细胞HepG2,并检测6Ckine/IFNγ融合蛋白的表达。结果所构建的重组腺病毒Ad-6Ckine/IFNγ经扩增和纯化后,滴度为1.26×1010IFU/ml。PCR法鉴定无野生型腺病毒的污染,所携带的6Ckine/IFNγ融合基因能在真核细胞中得到表达,表达形式为分泌型。结论已成功构建重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNγ,并在真核细胞中表达,为进一步研究肿瘤的基因和免疫治疗奠定了基础。     

重组丙型肝炎病毒腺病毒载体疫苗rAd/E2的构建及鉴定

目的构建含丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)E2基因的复制缺陷型重组腺病毒载体疫苗,并进行鉴定。方法以含HCV(1a亚型)E2基因的质粒pEGFP-HCV/E1E2为模板,PCR扩增E2基因,扩增产物与pGEM-T载体连接,测序正确后双酶切亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/E2,Pme I酶切线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd/E2,PacⅠ酶切线性化后,脂质体LipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞进行包装,获得重组腺病毒rAd/E2,在HEK293细胞内扩增,利用报告基因GFP的表达监测病毒包装及感染效率,PCR、RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,并测定各代病毒的滴度。结果测序结果证明HCV E2基因序列正确;重组腺病毒质粒pAd/E2经酶切证明重组成功;PCR、RT-PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒rAd/E2构建正确;第4代重组腺病毒的滴度为7.5×108 pfu/ml。结论已成功构建了重组HCV腺病毒rAd/E2,为丙型肝炎疫苗的研制提供了新的途径。     

anti-Benzo[a]pyrene-7,8-diol-9,10-epoxide Treatment Increases Levels of the Proteins p53 and p21WAF1 in the Human Mammary Carcinoma Cell Line MCF-7

The tumor suppressor p53 is involved in the recognition of DNA damage induced by radiation and chemicals. The effect of polycyclic hydrocarbons on p53 was investigated by treating MCF-7 cells with anti-benzo[a]pyrene-7,8-diol-9,10-epoxide (B[a]PDE), an ultimate carcinogenic metabolite of benzo[a]pyrene. Western blotting of lysates with antibody mAb1801 showed that B[a]PDE doses of 0.1 to 0.5 μM caused detectable increases in p53 protein. In cells treated with 0.3 μM B[a]PDE, p53 protein levels increased by 2 hours after treatment, reached a maximum between 8 and 24 hours and returned to control value by 120 hours after treatment. Levels of p21^WAF1 protein increased by 8 hours after treatment, reached a maximum by 48 hours and returned to control value by 168 hours after treatment. B[a]PDE-DNA adducts were quantitated by [γ-³³P]ATP postlabeling and separation on reverse-phase HPLC. Adduct levels dropped rapidly between 2 and 24 hrs after treatment (48 to 15 pmol/mg DNA), and subsequently decreased more slowly (12 pmol/mg DNA at 48 hrs to 3 at 168 hrs). By 96 hours after treatment, p53 protein levels were comparable to those from untreated controls, although a low level of B[a]PDE-DNA adducts remained. Cells treated with B[a]PDE also incorporated significantly less [³H]thymidine into DNA than did untreated cells for at least 24 hours after treatment. These results provide preliminary evidence that B[a]PDE-induced DNA damage is recognized by a p53-dependent signal transduction pathway and suggest that cell cycle arrest occurs during the repair of the majority of the B[a]PDE-DNA adducts.     

人乳头状瘤病毒16亚型E6E7基因重组腺病毒的构建及其在小鼠骨髓源树突状细胞中的表达

目的 构建人乳头状瘤病毒16亚型(Human papillomavirus 16,HPV16)E6E7基因重组腺病毒,并在小鼠骨髓源树突状细胞(Dendritic cell,DC)中表达。方法双酶切质粒pET-32a(+)-E6E7获得E6E7,基因片段,插入腺病毒穿梭质粒pAd-Track-CMV中,转染HEK293细胞,扩增病毒,经同源重组、包装后获得重组腺病毒pAd-E6E7,转染体外培养的小鼠骨髓源DC,激光共聚焦显微镜观察转染的小鼠DC的形态,流式细胞术检测转染前后小鼠DC表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C),Western blot检测E6蛋白的表达。结果双酶切及测序证实,重组腺病毒质粒pAd-E6E7构建正确,插入的E6E7基因片段序列正确;转染HEK293细胞48 h,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,重组腺病毒的滴度为3×107 CCID50/ml;重组腺病毒pAd-E6E7感染后DC的状态与成熟DC表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C)相符合,感染后的DC表面有许多树枝状、刺状突起,符合成熟DC的表面形态;感染后的DC中存在E6蛋白的表达。结论已成功构建了HPV16 E6E7基因重组腺病毒表达质粒,其能在小鼠骨髓源DC中表达。     

腺病毒载体介导gag基因在小鼠体内的生物分布

目的研究腺病毒载体介导gag基因在C57BL/6小鼠体内的生物分布。方法经C57BL/6小鼠左后肢股四头肌部位单次注射0.05ml Ad-gag,于给药后不同时间摘取组织脏器,采用Taqman探针实时荧光定量PCR法,以小鼠β-actin基因作为内参,外标绝对定量法分别定量样本中gag和β-actin基因拷贝数。计算每104个小鼠细胞中gag基因的拷贝数,比较各脏器的分布数量。结果外标绝对定量法精密性良好。gag基因主要分布在注射位点、淋巴结、脾脏和肝脏,其他脏器没有分布。给药后3d,gag基因在靶器官分布达峰值,注射位点分布最多,伴随时间延长逐渐减少。结论Ad-gag疫苗在体内不会蓄积并产生全身的特别是生殖系统毒性。本研究可作为重要的安全性试验数据,支持药物在临床应用。