白喉类毒素残余毒性检测新方法的建立

目的建立检测联合疫苗中白喉类毒素残余毒性的新方法,以替代现有的家兔皮肤试验法。方法采用Vero细胞法检测白喉类毒素的残余毒性,对该方法的特异性、灵敏度(最低检测限)和重复性进行验证,并对Vero细胞法与家兔皮肤试验法测定白喉类毒素残余毒性的结果进行比较。结果 Vero细胞可特异性检测白喉类毒素的残余毒力,该方法的最低检出限为10-8 LD50白喉毒素,重复性良好,灵敏度比家兔皮肤试验法高10 000倍。结论 Vero细胞法可用于白喉类毒素残余毒性检查和毒性逆转检查,该方法特异性强,灵敏度高于家兔皮肤试验法,适用于以白喉、破伤风为基础的联合疫苗(DT-based combined vaccines,DT combos)的安全性评价。     

多价肺炎链球菌荚膜多糖结合物对小鼠免疫应答的影响

目的探讨多价肺炎链球菌荚膜多糖结合物对小鼠免疫应答的影响。方法分别用单一载体(破伤风类毒素)和混合载体(破伤风类毒素和白喉类毒素)作为多糖结合物的载体蛋白,制备5～9价肺炎链球菌荚膜多糖结合物,免疫NIH小鼠,采用间接ELISA法测定免疫小鼠血清中抗荚膜多糖特异性IgG抗体水平。结果多价肺炎链球菌荚膜多糖结合物的免疫效果优于相应的单价结合物;随着结合物配制价数的增高,小鼠的免疫应答能力趋于下降;多价结合物中使用两种载体能缓解此现象,但载体含量过高时,依然会抑制免疫应答。结论多价肺炎链球菌荚膜多糖结合物免疫小鼠后,随着载体剂量的增高,会出现载体诱导的表位抑制现象,使小鼠的免疫应答反应减弱。两种载体蛋白同时使用能缓解此现象。     

无细胞百白破疫苗加强免疫一年后的血清抗体水平

用无细胞百白破疫苗（DTPa）和全细胞百白破疫苗（DTPw）分别进行基础免疫，再用DTPa或DTPw加强免疫，一年后对免疫儿童进行了血清抗体检测。结果各类抗体均较加强免疫后一个月明显下降，3个组中抗—FHA虽有所下降，但均在保护水平以上（＞20EU／ml），抗—PT抗体只有DTPa组大于20EU／ml。3个组中的大多数儿童的百日咳凝集抗体均＜1：320，而抗白喉类毒素（抗—DT）、抗破伤风类毒素（抗—TT）抗体均在保护水平以上。     

3种不同载体蛋白C群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗在小鼠体内免疫原性的比较

目的比较白喉无毒突变体(cross-reactive material 197,CRM197)、白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)及破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)3种不同载体蛋白C群脑膜炎球菌荚膜多糖(group C meningococcal polysaccharide,GCMP)结合疫苗在小鼠体内的免疫原性。方法在碳二亚胺[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]的缩合作用下,将TT和DT用1,6-己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)进行衍生,制备TTAH及DT-AH衍生物,GCMP再分别与TT-AH、DT-AH及CRM197共价结合制备结合物,经Sepharose 4FF凝胶柱分离纯化后,进行化学检测、相对分子质量测定及鉴别试验。用GCMP及3种结合物经皮下注射NIH小鼠,第0、14、28天各免疫1次,分别于首免后第7、21和35天经小鼠颈动脉采血,分离血清,ELISA法检测抗体效价。结果GCMP-TT和GCMP-DT的糖/蛋白比及多糖回收率较高,GCMP-CRM197较低,3种结合物游离多糖的含量均在5%以下,相对分子质量分别为5.8×10~6、2.8×10~6、1.1×10~6,且均可与GCMP的诊断血清产生沉淀线。3种结合物在小鼠体内均能产生良好的免疫原性,抗体水平均明显高于多糖组(P0.05);免疫2针后,GCMP-TT与GCMPDT组的抗体水平差异无统计学意义(P0.05),而GCMP-TT和GCMP-DT组的抗体水平明显高于GCMP-CRM197组(P0.05);免疫3针后,GCMP-TT组小鼠产生抗体水平明显高于GCMP-DT及GCMP-CRM197组(P0.05)。结论 3种不同载体的GCMP结合物免疫小鼠后均可产生良好的免疫应答,对于共价结合的方法,载体蛋白TT优于其他两种载体。     

吸附精制白喉—破伤风二联类毒素成人接种后的血清学效果

本文报告用两种配方的吸附精制白喉—破伤风二联类毒素(DT),在浙江省黄岩县中学生和青工中进行免疫效果观察。免疫后1个月、 1年和3年白喉抗体保护水平分别达95％、88％和80％以上。免疫后1个月和1年破伤风抗体保护水平分别达85％和81％以上。白喉和破伤风免疫后抗体滴度的几何平均值(GMT)分别比免疫前增加4～28倍和7～11倍。表明该制剂接种1次即可获得较为满意的血清学效果,可供青少年和成人作加强免疫或应急接种用。     

絮状试验用白喉和破伤风类毒素标准的国际协作试验

按照国际协作试验计划,本试验用 Ramon 絮状试验方法标化了絮状试验用白喉类毒素和破伤风类毒素国际标准各一批,推荐品即 DIFT 和 TEFT。本试验室标定结果与由13个实验室参加的国际协作标定结果几乎相同。以 DIFT 和 TEFT 为标准,用 Levine-Wyman 的试管絮状试验法和火箭电泳测定了几批白喉类毒素和破伤风类毒素的 Lf,其结果可与 Ramon 方法测定结果相比,证明火箭电泳可用于定量测定类毒素(或毒素)的絮状单位。     

肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗两种免疫途径对小鼠抗体应答的比较

目的比较肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗两种免疫途径对小鼠的抗体应答。方法选NIH小鼠,分别经皮下和腹腔途径免疫3次同等剂量的结合疫苗,每次间隔2周,用ELISA方法检测两种途径免疫小鼠的血清抗体滴度。结果结合疫苗经腹腔免疫后的抗体滴度优于皮下免疫。小鼠经腹腔免疫3次后,血清抗体的几何平均滴度分别是第1次免疫的6·6倍和3·5倍。结论结合疫苗经腹腔免疫较皮下免疫获得的抗体应答水平高。     

A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研制

目的 制备安全有效的Ａ群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。方法 通过碳二亚胺（ＥＤＡＣ）将Ａ群脑膜 炎球菌多糖－ＡＨ衍生物与破伤风类毒素（ＴＴ）蛋白共价结合,制备Ａ群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。结果 所结合 成的多糖－蛋白结合物,具有Ａ群脑膜炎球菌多糖和破伤风类毒素抗原特异性。单独用多糖免疫小鼠未能诱导出 高水平的血清Ｐｓ抗体,而用结合物免疫小鼠却诱导出高水平的血清Ｐｓ抗体及ＴＴ抗体,并有免疫记忆性。结论 为进一步临床评价该疫苗的人群免疫效果提供了实验基础。     

Vero细胞法测定白喉类毒素效价方法的建立

近年来,WHO已推荐用Vero细胞法代替经典的动物体内法,体外测定白喉抗体。为使我国的检定规程与WHO接轨,并配合上海、兰州两条DPT生产线通过世行的验收（其中白抗的测定要求使用Vero细胞法）,我们建立了Vero细胞法以测定白喉类毒素效价,并从不同方面验证了本方法的重复性与可靠性。1．实验的重复性格国家标准品与待检品DPT的免疫剂量进行3次试验,每个剂量的反应值见表1,从中可见3次试验中国家标准品结果一致,DPTI及DppZ因其本身效价不同而反应值可见差异,而Dppl的2次试验中反应值一致,第一次测定效价为452IU／nil,第二…     

b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备及免疫学特性

目的制备ｂ型流感嗜血杆菌结合疫苗,观察免疫学特性。方法通过已二酸二肼（ＡＤＨ）,将纯 化的荚膜多糖抗原与破伤风类毒素（ＴＴ）蛋白共价结合,制备ｂ型流感嗜血杆菌结合物。以２．５μｇ多糖或含２．５μｇ 多糖结合物经皮下免疫ＮＩＨ雌性小鼠,用ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清ＰＲＰ抗体及Ｔ抗体水平。结果用本实验方法提 取的多糖、合成的多糖衍生物、多糖－蛋白结合物都具有ｂ型流感嗜血杆菌的抗原特异性,其化学组成及结构特性 与国外文献报道结果基本一致。单独用多糖免疫小鼠未能诱导高水平的血清ＰＲＰ抗体,而用结合物免疫小鼠却诱 导出高水平的血清ＰＲＰ抗体及ＴＴ抗体,并存在免疫记忆性。结论本实验为进一步临床评价结合物的体内保护 性效果提供了实验基础。     

百日咳毒素兔多克隆抗体的制备及其ELISA定量检测方法的建立和验证

目的 制备百日咳毒素（pertussis toxin,PT）兔多克隆抗体（简称多抗）,建立定量检测PT抗原含量的双抗体夹心ELISA法,并进行验证及应用。方法 采用传统方法,用PT免疫青紫蓝兔制备PT兔多抗。优化ELISA系统反应条件,建立PT双抗体夹心ELISA定量检测方法,并进行特异性、线性、准确性、精密性、灵敏度验证。采用建立的方法对脱毒过程样品及其他百日咳抗原纯化过程样品菌毛蛋白（fimbriae proteins,FIM）原液中PT抗原含量进行检测。结果 PT抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的工作条件为PT兔多抗包被浓度为1μg/mL,酶标抗体稀释度为1∶8 000。此检测系统能与PT纯化蛋白发生特异性反应,而与百日咳丝状血凝素、白喉类毒素、破伤风类毒素均未发生交叉反应;建立的双抗体夹心ELISA法线性检测范围在25～400 ng/mL之间;PT高、中、低浓度回收率分别为103.27%、91.48%、103.52%;酶标板内和板间的变异系数（CV）均小于10%;该方法的灵敏度为20.719 ng/mL,检测下限为41.438 ng/mL。检测5种不同脱毒工艺条件下、不同取...     

第三批吸附白喉类毒素国家标准品的制备和标定

目的建立第三批吸附白喉类毒素国家标准品,用于效价测定。方法选用白喉疫苗生产菌株(PW8,CMCC38007),经复苏传代和产毒培养后,收获白喉毒素,采用先精制后脱毒的方法获得精制白喉类毒素原液,再加入氢氧化铝吸附后分装冻干,作为备选品。按《中国药典》三部(2010版)要求对原液和冻干品进行检定。以WHO国际标准品(07/216)和中国国家标准品(002)为标准,采用小鼠Vero细胞法在3个实验室进行协作标定。结果该批标准品的各项检测指标均符合国家标准品的规定;经协作标定,获得的20个效价单位标定结果合并统计后几何均值为289.3 IU/ml,95%可信区间为276.0~303.2;同时用WHO国际标准品(07/216)和中国国家标准品(002)进行标定比较,两者差异无统计学意义(P0.05);标准品效价稳定性考核结果证明,我国白喉类毒素国家标准品在保存期内效价稳定。结论所制备的标准品各项指标均符合要求,其效价定为289.3 IU/支,可作为第三批吸附白喉类毒素国家标准品用于效价测定。     

Vero细胞制备流感病毒疫苗

目的利用转瓶培养Vero细胞制备流感病毒疫苗。方法将流感病毒接种于Vero细胞上培养,优化培养条件,收获的病毒液经灭活、超滤浓缩和层析纯化,检测病毒的血凝素(HA)滴度及血凝素含量。按此工艺制备流感疫苗,根据血凝素含量稀释为不同浓度,免疫小鼠,观察不良反应,并通过血凝抑制(HI)试验检测抗体水平。结果Vero细胞培养流感病毒的最佳条件为:维持液中胰酶浓度12.5～15μg/ml,pH值7.4～7.6,Vero细胞经多次洗换后再接种病毒,病毒在细胞上培养72～96h收毒。所有免疫小鼠均未出现不良反应,小鼠抗体阳转率均为100%,HI抗体滴度均不低于同剂量的阳性对照组。结论Vero细胞可用于流感病毒的培养和制备疫苗。     

DTP—ELISA试剂盒的试制及应用

本文用 ELISA 法测定了普通人群和免疫前后人血清中白喉、破伤风及百日咳(DTP)抗体水平,并与经典的破伤风抗毒素小鼠中和试验(TNT)、白喉抗毒素家兔皮内中和试验(DNT)及百日咳细菌凝集试验(PA)进行了比较。同时试制出 DTP 血清抗体定性和定量检测药盒。结果表明,在人血清抗体测定中 ELISA 与 TNT、DNT 及 PA 的符合率分别为91.5%、97.9%和91.5%,三者间有良好一致性。20份免疫马血清破伤风抗毒素测定表明 ELISA 与 TNT 相关良好(r=0.84,P<0.01)。以国际上公认的免疫保护水平(TAT≥0.01IU/ml、DAT≥0.01IU/ml 和 PA≥1∶320)为标准,换算成 ELISAP/N 比值(≥2.1)作为试剂盒判断标准,测定了100份普通人群和81例 DTP 接种前后小儿血清,结果100份普通人群血清中含的抗白喉、破伤风及百日咳抗体者分别为28%、38%和45%;接种后小儿血清阳性率分别为88.9%、(白喉)、90.1%(破伤风)和81.5%(百日咳)。ELISA 法具有良好重复性和敏感性,简便经济,可作为临床和流行病学调查及菌苗效果监测的有效工具。     

腮腺炎疫苗与白喉、破伤风类毒素同时或分别接种的免疫应答

目的了解腮腺炎疫苗与吸附精制白喉、破伤风二联类毒素（ＤＴ）能否同时接种,为制定免疫方案 提供依据。方法用冻干流行性腮腺炎减毒活疫苗和吸附精制白、破二联类毒素同时和分别接种８～１４岁的寄宿 学生,观察其免疫应答。结果两苗同时接种与分别接种临床反应及免疫应答差异均无显著意义。结论两苗是 可以同时接种的。     

肺炎球菌结合疫苗诱导的抗荚膜多糖抗体活性研究

目的 研究肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物在小鼠体内诱导产生的功能性抗体活性。方法 用荚膜多糖及其结合物免疫BALB/c小鼠,用ELISA法测定小鼠血清IgG抗体,用KSCN解离法测定IgG抗体的亲和力,用体外调理吞噬实验测定血清的调理吞噬滴度。结果 18C-TT、19F-TT免疫小鼠后,抗体滴度显著升高,有免疫记忆反应,18C-TT第1针和第3针免后的抗体亲和指数(AI)分别为22.3％±4.8％和49.7％±1.8％,调理吞噬滴度分别达到16和32;19F-TT免后AI分别为52.6％±3.0％和61.6％±3.4％,调理吞噬滴度则分别为32和64。结论18C-TT和19F-TT免疫小鼠后,能有效地产生再次免疫应答,其IgG有良好的亲和力和补体依赖的调理吞噬功能,能有效地清除肺炎链球菌的感染。     

静注人免疫球蛋白(pH4)Fc段生物学活性检测条件的优化

目的优化静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulins,IVIG)Fc段生物学活性检测条件,并验证该方法的重复性。方法基于《中国药典》三部(2010版)人免疫球蛋白Fc段激活补体的试验方法,优化致敏红细胞的抗原(白喉类毒素)效价(25、50、100、150、200和250 Lf/ml)、IVIG浓度(5、10、20、30、40和50 mg/ml)和补体效价(15、50、75、100和150 CH50/ml)3个试验条件;采用优化的试验条件,对1批IVIG制品重复测定10次,计算变异系数(CV),验证该方法的重复性。结果在致敏红细胞的抗原(白喉类毒素)效价100～200 Lf/ml、IVIG浓度50 mg/ml和补体效价≥75 CH50/ml的条件下,补体介导的溶血反应动力学曲线呈典型的"S"型,可准确计算出IVIG Fc段激活补体的指数(IFc)。采用优化的试验条件,对1批IVIG制品重复测定10次,溶血反应动力学曲线几乎重合为一条,10次测定的IFc值的CV=8.91%。结论优化了IVIG Fc段生物学活性检测条件,优化后的检测方法重复性较好。     

用无细胞百日咳抗原配制的吸附精制百白破制剂的特性和人群反应及血清学效果

用50L发酵罐培养百日咳菌,经硫酸铵盐析法提取保护性抗原,戊二醛解毒后,与白喉、破伤风类毒素及Al(OH)_3配合制成的吸附精制百白破制剂(APDT),质量符合规程要求。给3～5月龄婴幼儿接种后全身和局部副反应很低,与现行吸附百白破制剂(WPDT)有非常显著性差异。免后血清中抗-PT和抗-FHA抗体均有显著增长,与WPDT制剂组相比,APDT的抗-PT和抗-FHA抗体增长更为显著。APDT免后抗白喉、抗破伤风抗体滴度均超过保护水平。本制剂的质量及免疫效果均达到了国外同类产品水平。     

精制白喉毒素的完全类毒化

精制白喉毒素加0.0125mol 赖氨酸,再加甲醛经适当的时间解毒,即可转化为完全类毒化的无毒性逆转的精制白喉类毒素。此等精白类的抗原性、效力稳定性、配成吸附制剂的吸附度以及解毒过程的 Lf/ml 损失,皆明显地优于单独用甲醛解毒生产的精白类。~H-赖氨酸结合试验表明,类毒化后,赖氨酸已结合到白喉类毒素分子中。     

肺炎链球菌免疫小鼠程序的优化及杂交瘤细胞株的建立

目的优化肺炎链球菌CSR SCS2 clone1小鼠的免疫程序,同时建立肺炎链球菌C多糖(C polysaccharides,CPs)杂交瘤细胞株。方法制备免疫抗原CSR SCS2 clonel,进行小鼠免疫程序优化:抗原量[(0. 5～2)×10~8个、(1～4)×108个、(2. 4～10)×10~8个)]、免疫间隔时间(3 d、1周、2周)、免疫途径(腹腔、腹股沟及尾静脉),同时确定抗原是否添加佐剂,间接ELISA法检测小鼠血清抗体水平。采用优化程序免疫小鼠,取血清效价最高的小鼠脾细胞,经传统单克隆抗体制备技术建立肺炎链球菌C-Ps杂交瘤细胞株,并检测细胞株的染色体数目及其分泌抗体的稳定性及特异性。结果确定小鼠最适免疫程序为:抗原量为(1～4)×108个,且需添加弗氏佐剂,免疫间隔时间为1周,免疫途径为腹股沟注射。最适程序免疫小鼠血清抗体效价达1∶12 000以上。建立了3株肺炎链球菌C-Ps杂交瘤细胞,命名为A4、G8、H10株,染色体数目分别为98、102和102,分泌的抗体具有良好的稳定性和特异性。结论成功优化了肺炎链球菌小鼠的免疫程序,并建立了肺炎链球菌C-Ps杂交瘤细胞株,为肺炎链球菌荚膜多糖中C-Ps含量检测方法的建立奠定了基础。