高产高纯度果胶甲酯酶黑曲霉工程菌的构建

为获得一株高产高纯度的果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌,提高果胶甲酯酶的产量,从果胶酶生产菌种中克隆了果胶甲酯酶基因pmeA,通过同源重组的原理,冻融法转化农杆菌、农杆菌介导法转化黑曲霉方法,成功构建了分泌表达果胶甲酯酶的纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）。基本发酵培养基中发酵第9 d上清中最高酶活达到467.77 U/mL。进一步敲除重组菌株TH-2（glaA::pmeA）中背景蛋白酸稳定的α-淀粉酶的编码基因asaA,获得纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA?pyrG?asaA）。该菌株在添加1%的硫酸铵的发酵培养基中培养7 d后,发酵液上清中主要的背景蛋白均消失。但是与纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）相比,果胶甲酯酶表达量有所下降,最高酶活为255.40 U/mL。重组果胶甲酯酶的最适作用温度为50 ℃,适合的温度范围是40~80 ℃,在80 ℃下仍能维持其酶活性的70%以上,适合的pH范围是3.0~5.0,最适pH为4.0。最终获得了一株温度和pH作用范围较宽的高产高纯度果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌。     

黑曲霉SH-2基因组中注释的7个α-葡萄糖苷酶基因的鉴定与表达分析

已公布的黑曲霉CBS513.88基因组中注释了7个α-葡萄糖苷酶基因信息,但其中主要高活性基因一直未报道。本文通过同源重组构建了黑曲霉SH-2菌株7个α-葡萄糖苷酶基因的系列多重敲除株。α-葡萄糖苷酶活性测定结果显示仅agdB敲除株的酶活相较于野生株SH-2降低36%,而其余多重敲除株菌株酶活影响较小。以敲除糖化酶、淀粉酶背景的黑曲霉SH-2-3菌株为宿主,分别敲除和过量表达基因agdB及与已报道的黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因序列相似度最高的基因agdA,结果显示agdB敲除株生长速度在不含葡萄糖的培养条件下最慢,并随着葡萄糖添加量增加;agdB过量表达株酶活提高到野生型的10倍。本研究结果说明目前黑曲霉SH-2基因组中所注释的7个α-葡萄糖苷酶基因中仅agdB为主要高活性α-葡萄糖苷酶基因（占总体酶活36%）,黑曲霉SH-2中α-葡萄糖苷酶基因仍需进一步探索。     

RNA干扰技术降低黑曲霉细胞工厂的内源蛋白背景

利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)改造黑曲霉细胞工厂,减少其内源蛋白表达背景。研究RNAi载体中反向互补片段特异性对RNA干扰的影响,同步干扰糖化酶基因glaA、淀粉酶基因amyA及蛋白酶调控因子基因prtT,并利用经RNA干扰改造的黑曲霉宿主SH-2表达异源脂肪酶基因tll。研究结果表明,不同长度的靶基因反向互补片段表现出不同程度的RNA干扰效应,载体pAMDS-RNAi-glaA388对糖化酶的干扰效果(94.40%)比载体pAMDS-RNAi-glaA784(70.60%)好;经三基因RNAi载体pAMDS-multi-RNAi改造的黑曲霉菌株中glaA、amyA、prtT的表达量仅为原始菌株的5.30%、17.10%和34.60%;利用经三基因RNAi载体改造的黑曲霉菌株表达脂肪酶tll,最高酶活达到97.27 U/mL,比利用原始菌株表达tll的最高酶活(73.05 U/mL)提高33.16%。因此,RNAi技术可以有效降低黑曲霉宿主内源蛋白的表达背景,有利于提高外源基因在黑曲霉细胞工厂中的表达水平和稳定性。     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达及其发酵条件优化

以枯草芽孢杆菌为表达系统,以中温α-淀粉酶为目标蛋白,研究了启动子和信号肽对外源蛋白表达分泌的影响。分别选取了4种启动子以及8种信号肽来进行筛选,结果表明,启动子PApr E的强度最高,信号肽SPnpr E的分泌效率最好。针对重组菌株1A751Q31进行系统的发酵优化,在72 h发酵液中α-淀粉酶酶活达到380U/m L。在7.5 L发酵罐中进行放大实验,发酵液中α-淀粉酶酶活最高达到853 U/m L。以上研究表明,α-淀粉酶适合在枯草芽孢杆菌中进行表达,同时表明枯草芽孢杆菌是良好的异源蛋白表达系统。     

多聚半乳糖醛酸酶在黑曲霉中的超量表达及其酶学性质研究

运用基因工程手段,构建高效表达多聚半乳糖醛酸酶的黑曲霉重组菌株,并对重组酶活性及酶学性质进行研究,以期更好的实现多聚半乳糖醛酸酶在食品加工、饲料生产及废水处理中的重要作用。从果胶酶生产菌黑曲霉GJ-1中扩增得到多聚半乳糖醛酸酶基因pgaB的成熟肽编码序列(1232 bp),集成glaA多拷贝强启动子和信号肽,构建其黑曲霉表达载体pSZHG6RS-pgaB,通过农杆菌介导法转化黑曲霉,获得多聚半乳糖醛酸酶黑曲霉重组菌株。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果表明,目的蛋白大小约为38 kDa;在发酵第10 d时酶活最高达到4617.8 U·mL-1。酶学性质研究表明,最适温度为50℃,高温时热稳定性较差;最适pH为5.0,碱性耐受能力较强;Ca2+、Fe3+、Fe2+均对重组酶有一定激活作用;重组酶对不同底物的催化能力不同,甲酯化程度越高酶对其降解能力越弱,其中对无甲酯化的多聚半乳糖醛酸催化能力最强,DE值为33.04%。重组菌株产酶活性较高,具有明确的产业化前景。     

葡萄糖氧化酶基因在黑曲霉中的分泌表达

通过PCR扩增从一株葡萄糖氧化酶生产菌黑曲霉中克隆得到1818bp葡萄糖氧化酶基因GOD,将GOD基因与糖化酶基因的5’同源臂、3’同源臂进行重叠延伸,构建葡萄糖氧化酶基因的表达框。将此表达框插入载体pSZH中,构建黑曲霉同源重组表达载体pSZH-GOD。将载体pSZH-GOD通过冻融法转化农杆菌AGL1,进而通过农杆菌介导法转化高产糖化酶的黑曲霉。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得8株重组菌株。对8株重组菌株的发酵液上清液进行酶活测定,结果表明葡萄糖氧化酶基因在高产糖化酶的黑曲霉中得到了分泌表达,静置培养6d后其分泌表达的葡萄糖氧化酶酶活最高可达1.166U/mL,而在出发菌株中检测不到葡萄糖氧化酶的分泌表达。同时,重组菌株胞内表达的葡萄糖氧化酶最高酶活可达11.45U/mL,是出发菌株的266倍。此研究结果为简化葡萄糖氧化酶发酵生产工艺、提高酶产量提供了新的途径。     

α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

α-淀粉酶基因经改造后,克隆到穿梭质粒pBE2中。在α-淀粉酶基因的上游连接枯草芽孢杆菌sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR),构建了含突变α-淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体pBSAT,转化蛋白酶三缺陷枯草芽孢杆菌菌株DB403。含有pBSAT的菌株可将突变α-淀粉酶分泌到胞外,表明sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR)能很好的将枯草芽孢杆菌中的重组α-淀粉酶引导到胞外,完成分泌表达。分泌的α-淀粉酶具有较高的耐酸性及生物学活性。     

酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

酸性α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现酸性α-淀粉酶基因的高效表达,将本实验室已经克隆得到的去信号肽的酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌WB600宿主中进行表达,成功的构建了表达菌株pHT43-amy/WB600。在初始菌浓度OD600为0.8时加入终浓度为0.9 mmol/L的IPTG,诱导6 h的条件下测得酶活力为1 230 U/mL,又由于宿主菌WB600外分泌蛋白较少,因此具有明显的生产优势。     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。     

嗜热酸性普鲁兰水解酶Ⅲ的高效分泌表达及其酶学性质

本文探索了嗜热酸性普鲁兰水解酶Ⅲ Tk-PUL在枯草芽孢杆菌表达系统中的高效分泌表达条件,并对重组Tk-PUL的酶学性质进行了初步研究。通过构建Tk-PUL分泌表达信号肽筛选库,并结合高通量筛选方法,确定引导Tk-PUL在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达的信号肽。结果表明,在信号肽AmyE的引导下,重组Tk-PUL在枯草芽孢杆菌表达系统中高效分泌表达。Tk-PUL属于单结构域双功能酶,同时具有α-淀粉酶活性和普鲁兰酶活性。重组Tk-PUL的α-淀粉酶活性的最适反应pH为4.5,最适反应温度为100℃,对应的绝对酶活为54.08 U/mg,于100℃的半衰期约为2 h。重组Tk-PUL的普鲁兰酶活性的最适反应pH为4.5,最适反应温度为100℃,对应的绝对酶活为110.39 U/mg,于100℃的半衰期约为2 h。本研究为Tk-PUL在淀粉酶法制糖工业中的应用奠定了基础。     

冬小麦膨胀素基因EXPB7工程菌构建及纤维素水解作用分析

为了寻找促进纤维素降解的有效方法来提高纤维素酶的降解效率。本研究以东农冬麦1号膨胀素基因EXPB7为供体,构建黑曲霉表达载体,以黑曲霉CICC2462为受体,采用农杆菌介导法遗传转化黑曲霉,构建膨胀素基因黑曲霉工程菌pSZHGS-EXPB7,并对该工程菌发酵液的纤维素水解促进作用进行分析。结果表明,黑曲霉重组膨胀素蛋白在对滤纸处理2 d后崩解效果明显,与出发菌株的分泌蛋白相比,具有一定的促进作用;重组菌株发酵液上清处理滤纸产生的还原糖含量显著高于出发菌株(P<0.05),与仅用酶液处理滤纸相比,能够将纤维素酶的水解效率提高32.9%。     

黑曲霉TNA-09中α-葡萄糖苷酶基因敲除的研究

以柠檬酸生产菌黑曲霉TNA—09为原始菌株,通过农杆菌介导的方法,将其α-葡萄糖苷酶基因敲除,得到基因敲除菌株TGA101。对原始菌株黑曲霉TNA-09和基因敲除菌TGA101 α-葡萄糖苷酶活力测定,结果相对于TNA—09菌株,TGA101菌株α-葡萄糖苷酶活力下降61．15％。在柠檬酸发酵试验中表现出相对于黑曲霉TNA-09,TGA101菌株发酵液中异麦芽糖含量降低84．67％,柠檬酸提高2．34％,糖酸转化率提高2．34％。     

亮氨酸氨肽酶LapA在无孢黑曲霉中的重组表达优化及酶学性质

针对目前国产食品级亮氨酸氨肽酶的工业生产产量不高的现状,将米曲霉、黑曲霉和酱油曲霉的5 个亮氨酸氨肽酶基因（lapA、lap1O、lap2、lap1S、lap1N）在低蛋白背景的无孢黑曲霉HL-1中进行重组表达,通过信号肽替换对其编码区进行改造,利用杂合启动子PnaII及营养缺陷标记pyrG构建表达载体,并基于规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）/Cas9工具设计亮氨酸氨肽酶的基因组定点整合策略,获得高活力的亮氨酸氨肽酶表达菌株,重组菌株LapA-C的亮氨酸氨肽酶活力达到11 701.2 U/mL,比未利用CRISPR工具的LapA-T重组表达菌株的酶活力（2 476.0 U/mL）提高了约3.7 倍。此外,通过融合6×His标签实现了重组亮氨酸氨肽酶LapA的纯化,并对其进行了酶学性质研究：蛋白质大小约为35.0 kDa,重组亮氨酸氨肽酶LapA最适pH值为8.5,最适温度为65 ℃。综上所述,本研究基于CRISPR策略成功实现了亮氨酸氨肽酶在黑曲霉中的高效重组表达。     

利用玉米粉产柠檬酸黑曲霉的筛选

以从土壤中分离的黑曲霉为出发菌种,经过紫外线和DES的诱变处理,得到了一株能利用玉米粉为原料的黑曲霉菌株AS35.经过摇瓶发酵柠檬酸的对照试验,结果表明:该菌株能够较好地利用玉米粉,产酸能力达8.6%,原料转化率达66.2%,较原始菌种大大提高.     

人工发酵小麦酱生产工艺的研究

采用米曲霉、黑曲霉混合人工发酵小麦酱,通过单因素以及正交试验对影响小麦酱人工接种发酵工艺的因素,包括菌种接种量、食盐用量、发酵时间、发酵温度、乙醇用量进行优化筛选.最后确定最佳发酵工艺条件为:米曲霉和黑曲霉分开制曲,混合发酵,二者菌株添加比例为8∶1,接种量为0.3％,添加9％的食盐及0.5％的乙醇,在定期揿酱的前提下,28-40℃间歇式控温发酵35天;所得人工接种发酵产品氨基酸态氮值高,且感官评价较好,与传统自然发酵小麦酱风味相似.     

酸性蛋白酶高产菌株选育

以黑曲霉ＪＷ３０３９为出发菌株，通过ＥＭＳ多次诱变处理及最适培养和发酵条件的摸索，使其酸性蛋白酶产量从１８００～２０００ｕ／ｍｌ提高到３３００ｕ／ｍｌ。     

菌种接种方式对黄豆酱品质的影响

以沪酿3.042米曲霉、AS 3.35黑曲霉、AS 3.324甘薯曲霉、沪酿3.130毛霉、AS 3.972红曲霉、米根霉和枯草芽孢杆菌为菌种进行制曲、发酵,通过测定发酵7 d后蛋白酶活力和氨基酸态氮含量,研究单菌种制曲发酵、曲料混合发酵和多菌种混合制曲发酵方式对黄豆酱品质的影响。结果表明:曲料混合发酵产蛋白酶活力和氨基酸态氮含量效果最好,其次为多菌种混合制曲发酵和单菌种制曲发酵。曲料混合发酵和多菌种混合制曲发酵中,2菌种和3菌种组合产蛋白酶活力和氨基酸态氮含量整体较高,其中曲料混合发酵5号(沪酿3.042米曲霉、AS 3.35黑曲霉和枯草芽孢杆菌)产蛋白酶活力和氨基酸态氮含量最佳,分别达到713 U/mL和0.89 g/100 g。研究发现,沪酿3.042米曲霉成曲、AS 3.35黑曲霉成曲和枯草芽孢杆菌成曲按照曲料混合发酵方式接种更有利于得到品质较优黄豆酱。