宇佐美曲霉木聚糖酶的纯化及其性质

宇佐美曲霉E001固态发酵成熟曲经水浸提、硫酸铵盐析、Phenyl-SepharoseCL-4B疏水层析、SephadexG-75凝胶过滤层析、DEAESepharosefastflow阴离子交换层析等提纯步骤,获得了比酶活3047IU/mg蛋白的纯木聚糖酶,其SDS-PAGE呈单一条带。用SDS-PAGE和凝胶过滤测得木聚糖酶的相对分子质量分别为23.2kD和23.0kD,表明该酶蛋白为单亚基。纯木聚糖酶的最适作用温度和pH值分别为50℃和4.6;以燕麦木聚糖为底物的酶动力学常数Km和Vmax值分别为5.27mg/ml和6494μmol/(min·mg);Ca2+、EDTA对酶有激活作用,而Sn2+、Pb2+、Fe3+有强烈的抑制作用。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因的克隆和序列分析

依据宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001木聚糖酶(XynII)N末端氨基酸残基序列以及曲霉菌密码子的偏爱性和真核生物mRNA在3′端存在Poly(A)等所提供的生物信息,采用RTPCR技术扩增了XynII成熟肽和3′非编码区的cDNA片段,PCR产物直接克隆至pUCmT载体中。DNA序列分析表明,该cDNA全长733bp,其中3′非编码区178bp,成熟肽编码区555bp,编码184个氨基酸。成熟肽基因推导的氨基酸序列同Aspergillusniger、Emericellanidulans以及Trichodermaviride来源的木聚糖酶相比,同源性分别为89%、46%和36%。又进一步对XynII二级结构进行了分析,并通过SWISSMODEL预测了XynII的三维结构。     

宇佐美曲霉木聚糖酶粗酶性质研究

本文对宇佐关曲霉(Asp．usamii)产木聚糖酶的产酶进程进行了分析，28℃固态静置培养72h，酶活力可达到7442IU／g干曲。粗酶酶学性质研究表明：该木聚糖酶的最适反应温度50℃，低于50℃时较稳定；酶的最适pH4．6，pH稳定范围为pH5．0-10．0。Ca^2 对酶有激活作用，而Mn^2 、Mg^2 、Ba^2 则具有强烈的抑制作用。     

宇佐美曲霉酸性β-甘露聚糖酶的纯化及性质研究

采用硫酸铵分部盐析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析、DEAE Sepharosefast flow阴离子交换层析等分离技术,从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78菌株固态曲浸出液中分离出1种SDS-PAGE电泳纯和HPLC色谱纯的酸性β-甘露聚糖酶组分,其最终回收率为12.6%,纯化倍数为32.3。经SDS-PAGE和凝胶过滤层析测得该纯化酶的分子质量分别为42 ku和40 ku,表明该酶以单体形式存在;其等电点pI为4.2;含糖量为23.2%。以角豆胶半乳甘露聚糖为底物,测得该酶的Km值和Vmax值分别为6.3 mg/mL和1 667μmol/(min.mg)。     

宇佐美曲霉产木聚糖酶的固态发酵条件研究

研究了培养基组分及培养条件对宇佐美曲霉(Asp usamii) 固态发酵产木聚糖酶的影响。采用Plack ett Burman和Box Behnken实验设计确定了最佳培养基组成和培养条件为:麸皮3 4g ,玉米芯4 6 g ,NH4NO31% ,KH2 PO40 3% ,CaCl2 0 1% ,MgSO40 1% ,Tween 80 0 4 % (均为相对于固体料的质量百分数) ,液固比为1 2∶1;最佳初始pH为自然pH ,2 8℃静置培养72h ,其间翻曲2～3次。酶活最高达到74 4 2IU/g(干曲)。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达与优化

从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001中克隆木聚糖酶基因xynⅡ,将不含原酶信号肽编码序列的xynⅡ以正确的读码框克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建成重组质粒pET-Xn并转化大肠杆菌,得到重组工程菌KN21。通过对其进行IPTG浓度、温度等诱导培养条件的优化后,胞内重组木聚糖酶活力最高达到81.77U/mg。对重组木聚糖酶进行酶学性质研究,显示其最适温度为45℃,最适pH为4.5。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达与优化

从宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）E001中克隆木聚糖酶基因xynⅡ,将不含原酶信号肽编码序列的xynⅡ以正确的读码框克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建成重组质粒pET-Xn并转化大肠杆菌,得到重组工程菌KN21。通过对其进行IPTG浓度、温度等诱导培养条件的优化后,胞内重组木聚糖酶活力最高达到81.77U/mg。对重组木聚糖酶进行酶学性质研究,显示其最适温度为45℃,最适pH为4.5。      

米曲霉RIBl28耐酸性木聚糖酶的研究

通过RBB-Xylan筛选平板和固体培养方法获得了产木聚糖酶菌株米曲霉(Aspergillus     

基因工程菌1020耐热木聚糖酶的纯化与性质

通过热变性处理和Ni-NTA层析分离纯化基因工程菌1020耐热木聚糖酶。对热变性条件优化,70℃处理30min效果,纯化倍数4.9;利用木聚糖酶C端6个His标记对Ni-NTA琼脂糖凝胶的结合性,一步层析得到电泳纯的木聚糖酶。酶的最适反应温度为110℃,具有高度耐热性,在70℃保温8h,酶活基本不变,100℃保温5h后,酶活残余40%;在pH6.0～10.0范围内都有较高的酶活性和稳定性。低浓度的异丙醇对酶反应有促进作用,Hg2+对酶反应有强抑制作用。该酶对燕麦木聚糖的Km为0.55mg/ml,Vmax=14.26μmol/min·mg。     

草菇木聚糖酶的纯化提取和酶学性质

草菇产胞外木聚糖酶通过各级浓缩和纯化,获得接近电泳纯蛋白.通过SDS PAGE测得相对分子质量为24500.木聚糖酶为糖基化修饰的蛋白,含有质量分数20.24%的糖.O 糖基化能增加木聚糖酶的活性,O 和N 糖基化都能提高木聚糖酶的稳定性.5min反应,草菇木聚糖酶在60℃和pH值5.65时活性最高.在此条件下,该酶的Km值为3.87mg/mL,Vmax为1250IU/mg.纯酶的稳定pH值为6.54,57℃时半衰期为1h.