重组角质酶的制备及合成乙酸乙酯条件优化

为了实现镰孢菌角质酶的高效表达,对重组菌株P. pastoris KM71/pPIC9K-ScCuA在3 L发酵罐进行了发酵工艺优化,获得的最优发酵条件为:诱导温度28℃,初始诱导菌浓OD600为100,诱导阶段甲醇体积分数为1%条件下进行诱导产酶。在该条件下发酵138 h时上清酶活可达到最大值419 U/mL,是优化前的2倍。对重组角质酶在有机溶剂中合成乙酸乙酯的酯化条件进行了优化,结果表明,当底物乙酸浓度为0.1 mol/L,乙醇浓度为0.15 mol/L,温度50℃,在异辛烷中反应16 h,乙酸乙酯可以达到最大转化率94.12%。     

特异腐质霉角质酶在大肠杆菌中的表达和发酵优化

应用大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)表达系统实现特异腐质霉(Humicola insolens,H.insolens)来源角质酶的重组表达。对重组角质酶进行酶学性质研究,发现其最适pH为8.5、最适温度为80℃,并有良好的pH稳定性和温度稳定性。经3L发酵罐中扩大培养并进行发酵条件优化,其最佳发酵条件:发酵前期控制菌体生长pH 7.0、温度37℃,培养时间12~14h;菌体浓度OD600达到50时进入诱导期,调节温度降至30℃,恒速流加0.2g/(L·h)的乳糖溶液进行诱导,总发酵周期为36h,最高酶活2 233U/mL,是摇瓶水平酶活的13倍。     

突变T.fusca角质酶对涤纶织物表面水解作用研究

本文研究突变T.fusca角质酶对涤纶织物表面水解作用,确定反应条件(酶质量浓度、时间、温度和pH值)、金属离子体积浓度对涤纶织物酶解产物释放量及其表面润湿性能的影响。结果表明,该突变T.fusca角质酶可以水解涤纶表面酯键,且主要的水解产物是对苯二甲酸。处理后的涤纶表面润湿性能得到改善,可实现由疏水到亲水的转变。突变T.fusca角质酶水解涤纶的适宜反应条件为：酶质量浓度20 U/g,反应时间48 h,反应温度60℃,pH值8。在此条件下,突变T.fusca角质酶与Ca²⁺表现出明显的协同作用,水解产物释放量较单独用酶处理提高53%。     

重组大肠杆菌产普鲁兰酶发酵条件优化

在7L发酵罐规模,利用自诱导培养方式,对重组大肠杆菌产普鲁兰酶发酵条件进行优化研究,主要考察了发酵过程中控制溶解氧浓度、p H和采用补料策略对菌体生长和普鲁兰酶表达的影响。结果表明,最佳发酵培养条件:溶氧浓度维持在20%~30%;p H保持在7.60;第9 h时,以0.8 g/(L·h)的速度流加甘油;在20 h,以0.2 g/(L·h)的速度流加乳糖。此条件下,重组菌的细胞浓度OD600 nm从12.58上升到42.25,提高了3.36倍;普鲁兰酶酶活力从356 U/ml上升到1 200 U/ml,提高了3.37倍。     

利用重组酵母菌株发酵混合碳源分泌表达角质酶

克隆来自Thermobifida fusca(嗜热放线菌)的编码角质酶基因tfu,并在N端人为添加了α-factor信号肽,以引导重组角质酶的分泌表达。在成功构建了重组菌株后,深入分析了半乳糖浓度对重组菌株表达角质酶的影响,并对诱导方式进行了优化分析。此外,还分析了混合碳源对重组菌株产角质酶的影响。依靠α-factor信号肽的引导,成功实现了重组酵母菌株角质酶的活性分泌表达。混合碳源实验表明,棉子糖和半乳糖的组合能够更好地促进角质酶的分泌表达,这为角质酶发酵生产及应用于食品医药及保健品行业提供了参考和借鉴。     

烟草赤星病菌(Alternaria longipes)产角质酶液体发酵条件的优化

以基础培养基（查彼培养基＋碳酸钙＋苹果角质）为营养优化了长柄链格孢(Alternaria longipes)产角质酶的环境和营养条件。结果表明最佳产酶的环境条件是：培养时间8 d,培养温度25 ℃,pH 5.5;通过正交试验确定最佳产酶的营养条件是：蔗糖3％,干酪素1％,吐温-80 0.3%;酶活高达175.2 U/mL,是基础培养基酶活力的11.0 倍。     

粗糙脉孢菌突变菌株合成漆酶的发酵条件研究

研究了影响粗糙脉孢菌突变菌株合成漆酶的一些摇瓶发酵条件，包括通气量、培养温度、甲醇浓度、Cu2＋浓度等。结果表明，在500mL三角瓶中装入含150μmol／L Cu^2＋浓度的发酵培养基BMMY 50mL，接种后于30℃，200r／min培养7d，用0．5％甲醇诱导，在第5天时漆酶酶活最高可达3．88u／mL。     

转谷氨酰胺酶高产突变株的紫外线诱变选育及发酵条件研究

以茂源链霉菌为出发菌株,对其进行紫外线诱变,通过初筛复筛,选育出性能稳定的高产突变菌株G-17,其酶活力达到0.86U/mL,相对于出发菌株提高了2.4倍。对影响突变菌株G-17摇瓶液态发酵条件进行了研究,确定发酵的最佳条件为:培养基初始pH为7.0,100μg/L CaCl2,接种量10%(V/V),发酵温度30℃,转速200r/min,摇床震荡培养48h;最佳发酵条件下,发酵液中转谷氨酰胺酶活力达到1.27U/mL。     

基于角质酶共表达策略的大肠杆菌胞外生产耐高温α-淀粉酶及其发酵条件优化

在前期工作中通过分子改造提高了来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶在高温酸性条件下的稳定性,同时改良了催化效率。为了实现α-淀粉酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的胞外高效表达,作者尝试采用共表达嗜热放线菌(Thermobifida fusca)角质酶来增强大肠杆菌膜透性,同时优化诱导策略以提高重组α-淀粉酶的胞外表达。首先构建了能同时表达角质酶和α-淀粉酶的工程菌BL21(DE3)/pETDuet-amy-cutinase,并将此菌株与能单独表达α-淀粉酶的工程菌BL21(DE3)/pET-20b-amy进行摇瓶和3 L发酵罐的产酶发酵对比。结果显示,共表达菌株在胞外产酶方面具有明显的优势。进一步对共表达菌株的诱导条件进行优化,在32℃、诱导剂为0.15μmol/L IPTG与0.5 g/(L·h)乳糖条件下,发酵32 h后胞外α-淀粉酶最高酶活力可达6.05×10~4U/m L,是单表达菌株摇瓶发酵水平的28.3倍。此时胞外重组α-淀粉酶质量浓度为8.92 g/L,重组蛋白质的分泌效率为93.2%。     

枯草杆菌Bacillus sp F26产过氧化氢酶的发酵条件

从内蒙古呼伦贝尔草原的盐碱湖中分离到的一株低度嗜盐嗜碱细菌Bacillus sp F26，能积累高水平过氧化氢酶（CAT）。对Bacillus sp F26发酵产过氧化氢酶的环境与营养条件的研究结果表明，其积累高水平过氧化氢酶的适宜环境条件为：温度37℃，种龄20-22h，接种量5％，装液量50mL／（250mL的摇瓶）。适宜发酵培养基组成（g／L）为：葡萄糖15，牛肉膏10，玉米浆10，酵母膏5，磷酸二氢钾1，氯化镁0．2，氯化钠50，碳酸钠10。采用上述条件进行摇瓶分批发酵实验，发酵20h，过氧化氢酶酶活达到16．32U／mL，细胞干重为4．12g／L。进一步研究发现，在对数生长后期（16h）添加2mmol／L的H2O2可以明显刺激产酶，在5L的发酵罐上进一步以指数速率方式流加H2O2，由于该流加方式可降低H2O2对细胞的毒害作用，过氧化氢酶酶活达到29．89U／mL，与分批发酵相比提高了92．8％。     

Thermobifida fusca麦芽三糖淀粉酶的重组表达及其在麦芽三糖制备中的应用

麦芽三糖淀粉酶以淀粉或麦芽糊精为原料,可生产麦芽三糖,在食品、饮料等行业具有广泛的应用前景。实验将Thermobifida fusca NTU22来源的麦芽三糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌WS11中进行重组表达,并进行酶学性质分析,重组酶的最适温度和pH分别是55℃和6.0。在此基础上探究了重组酶作用于麦芽糊精生产麦芽三糖的最佳条件。结果表明,以15%浓度的麦芽糊精(DE 5-7)作为底物时,酶转化的最佳条件是温度55℃、pH 5.5、加酶量60 U/g(底物)、普鲁兰酶加酶量32 U/g(底物)、反应时间11 h,此时得到麦芽三糖转化率44.4%。该研究为工业制备麦芽三糖提供了理论依据。     

褐色喜热裂孢菌Thermobifida fusca产麦芽糖α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以T.fusca基因组DNA为模板,PCR分别扩增不包括和包括其基因前段信号肽的产麦芽糖淀粉酶的基因片段tfa和sptfa,并克隆至表达载体pSE380上,获得重组质粒pSE380-tfa和pSE380-sptfa,以大肠杆菌JM109为宿主细胞大量表达融合蛋白,利用金属镍亲和层析对菌株JM109/pSE380-tfa表达的α-淀粉酶进行纯化,SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为64ku,K m值为1.305mg/mL,最适反应温度为60℃,最适pH为7.0;检测到菌株JM109/pSE380-sptfa的培养基上清有相当一部分酶活。本研究麦芽糖α-淀粉酶与可溶性淀粉反应,经HPLC检测产物均为麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖的混合物。因此麦芽糖α-淀粉酶在生产高麦芽糖浆上起到了一定的作用。      

抗乙硫氨酸突变株产蛋氨酸发酵工艺条件的优化

本实验研究了抗乙硫氨酸突变株E31 营养条件和培养条件的优化,结果表明：突变株E31 发酵产蛋氨酸营养条件的最佳配方是葡萄糖11%、尿素0.8%、MgSO4·7H2O 0.08%、生物素3μg/100ml,最佳培养条件组合是发酵培养基pH6、发酵温度33℃、接种量8%、发酵时间84h,在此条件下蛋氨酸产量为2.086g/L,比优化前蛋氨酸产量(1.479 g/L)提高了0.607g/L。     

耐氨米根霉菌株ST50-2产L-乳酸发酵条件研究

为研究耐氨米根霉菌株ST50-2产L-乳酸的发酵特性,采用氨水中和剂,进行7L反应器发酵实验。与ST50-2的出发菌株AS3.819相比,发酵周期由原来的72h缩短为56h,L-乳酸产量提高12.30%,乙醇含量降低22.22%,乳酸脱氢酶(LDH)比活力提高83.09%,乙醇脱氢酶(ADH)比活力降低16.06%,对还原糖的利用速率及生物量的积累均高于出发菌株。7L反应器发酵实验表明：CaCO3影响菌体的成球;搅拌转速、氨水体积分数影响菌体的生长、成球大小及L-乳酸产量;pH值影响L-乳酸产量及发酵周期。其优化结果为：在搅拌转速400r/min,中和剂氨水体积分数为15%,pH值控制在6.0时,ST50-2菌球直径为1.0～1.5mm,发酵周期为56h,L-乳酸产量达93.32g/L。     

纳豆激酶发酵条件的优化

利用Plackett-Burman 方法对影响纳豆芽孢杆菌液体发酵的各因素进行评价,筛选出对产纳豆激酶有显著效应的主要因素是豆饼粉浓度。在此基础上,用响应面分析法对发酵培养基中的豆饼粉浓度、CaCl2 浓度、葡萄糖浓度进行优化。所得的最优培养基成分为葡萄糖 1%、豆饼粉 3%、KH2PO4 0.2%、K2HPO4·3H2O 0.26%、MgSO4·7H2O 0.1%、CaCl2 0.12%。拟合实验结果显示,纳豆激酶液体发酵液的酶活由初始培养条件的约1800U/ml提高到优化后的2226.06U/ml。     

液态深层发酵龙眼果醋的工艺优化

该研究以龙眼为原料酿造龙眼果醋.通过单因素实验和正交实验,确定果醋发酵的最佳工艺参数.实验结果表明:龙眼酒精发酵最佳工艺条件为含糖量20%、发酵温度30℃、接种量8%,初始pH4.5;醋酸发酵过程中,当发酵温度35℃,酒精度8%,通气量1:4,接种量8%时,产酸量最佳.     

银杏豆酱发酵工艺条件优化

为开发具有保健功能的酱品,并提高银杏的深加工水平,对银杏豆酱的发酵工艺条件进行研究。通过单因素实验和正交试验确定银杏豆酱的最佳发酵工艺条件。实验结果表明,原料配比对银杏豆酱的感官和理化性质影响较大。优化的银杏豆酱发酵工艺条件为:黄豆:银杏粉:面粉质量比为10:3:2,制醅盐水浓度为120 g/L,45℃保温发酵30d。在此条件下生产出的银杏豆酱具有突出的银杏香气,口味纯正,感官品质较好,各项理化指标符合国家标准。     

嗜酸乳杆菌NX2-6产细菌素的发酵条件优化

在Plackett-Burman试验结果基础上,采用响应曲面法(Box-Behnken设计)对嗜酸乳杆菌NX2-6发酵产细菌素的关键影响因素,即葡萄糖质量浓度、乙酸钠质量浓度、柠檬酸三钠水合物质量浓度及培养时间的最佳水平范围进行研究和探讨。通过对发酵液抑菌圈直径的二次多项回归方程求解得知,在葡萄糖质量浓度、乙酸钠质量浓度、柠檬酸三钠水合物质量浓度和培养时间分别为60.0、8.0、5.0g/L和36h时,菌株NX2-6的发酵液抑菌圈直径预测值为21.37mm,验证实验抑菌圈直径实测值与预测值的相关系数R2为0.9918。优化后培养基与基础培养基相比,发酵液抗菌活性增加约80.0%,由此可见,利用响应曲面法对嗜酸乳杆菌NX2-6发酵产细菌素条件进行优化是经济有效且科学合理的。     

鹅肉香肠的发酵工艺研究

选用发酵乳杆菌和变异微球菌为复合发酵剂生产鹅肉香肠,并以样品感官评分、过氧化值(POV)作为考察指标,在单因素试验分析的基础上,采用多指标正交设计对发酵鹅肉香肠的发酵温度、发酵时间、接种量以及菌种比例进行优化。结果表明:鹅肉香肠的最佳发酵工艺条件为:发酵时间20h、发酵温度25℃、接种量1×107CFU/g、发酵乳杆菌和变异微球菌最佳比例1:1。在此条件下,发酵鹅肉香肠感官评分为96分,POV为2.3meq/kg。在最佳发酵条件下制得的发酵鹅肉香肠的还原力(A700nm)和DPPH自由基的清除率分别是0.45和85.7%,样品抗氧化效果好。