双抗夹心酶联免疫吸附法检测沙门氏菌

沙门氏菌是自然界中普遍存在的一种食源性致病菌,在中国的食物中毒中沙门氏菌引起的病例占第一位。本研究以福尔马林灭活的鼠伤寒沙门氏菌免疫雌性日本大耳兔,制备抗沙门氏菌多克隆抗体。以抗沙门氏菌多克隆抗体作为捕获抗体,以抗沙门氏菌单克隆抗体C1359作为检测抗体,建立快速检测沙门氏菌双抗夹心ELISA方法。结果表明:该方法可以检测A、B、C、D、E等五种典型的沙门氏菌,对沙门氏菌纯培养液的最低检测量为1×104CFU/mL,与其他杂菌不存在交叉反应,具有较好的灵敏性和特异性。     

酸土环脂芽孢杆菌的鼠源多克隆抗体制备及纯化

以耐热菌标准菌株(Aliyclobacillus acidoterrestris)为抗原,通过背部肌肉注射免疫SD大鼠,取血制备免疫血清,再通过饱和硫酸铵沉淀法和ProtainG亲和层析纯化制备耐热菌鼠源多克隆抗体,经测定抗体效价达到1:12800。经SDS-PAGE鉴定抗体为IgG,纯化效果好,与食源性常见菌无交叉反应,证明特异性良好。本研究首次建立了耐热菌鼠源多克隆抗体的制备及纯化方法,为耐热菌的酶联免疫检测研究提供了基础。     

牛奶过敏原β-乳球蛋白抗体的制备及免疫检测方法的建立

本文将牛奶过敏原β-乳球蛋白抗原分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠制备其多克隆抗体和单克隆抗体,并对所获得的抗体进行了效价等特性测定;采用蛋白A亲和层析法将多克隆抗体进行了纯化,采用辛酸-硫酸铵法对单抗细胞株3A7进行了纯化;实验建立了双抗体夹心的ELISA检测方法,并对一些蛋白样品进行了初步的检测。实验结果表明,所制备的抗β-乳球蛋白兔多克隆抗体效价达到了1:6.56×106;Western-blotting鉴定结果显示所制备的多克隆抗体能够与β-乳球蛋白特异性反应;3株单抗的效价均在106以上,纯化后多抗仅与酪蛋白有一定的交叉反应,而纯化后单抗与乳中主要蛋白及其它过敏原蛋白基本没有交叉反应,特异性很好;利用所建立的方法对一些蛋白样品进行检测,准确率100%。     

双抗夹心酶联免疫吸附快速检测冷鲜肉中的6 种血清型沙门氏菌

为快速检测冷鲜肉中的沙门氏菌,筛选出1 株产抗6 种沙门氏菌单克隆抗体的细胞株,运用产生的抗体建立酶联免疫吸附检测方法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）。实验采用6 种血清型致病沙门氏菌制备出混合抗原,对BALB/c小鼠及新西兰大白兔进行免疫,运用杂交瘤技术进行细胞融合,制备出抗沙门氏菌单克隆抗体以及多克隆抗体,并建立双抗夹心ELISA体系检测冷鲜肉中沙门氏菌。结果表明,成功筛选出1 株能稳定分泌抗沙门氏菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株6E7,保藏编号为CGMCC 10313以及多克隆抗体,效价分别为1∶1.28×106和1∶8.0×105 ;将多抗作为包被抗体吸附于96 孔酶标板上,并用辣根过氧化物酶标记单抗,建立双抗夹心ELISA体系;检测模拟污染肉样中沙门氏菌,其检测限为800 CFU/g;并与其他血清型沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌均无交叉反应,特异性良好。     

副溶血弧菌多克隆抗体的制备及其特性分析

确定了副溶血弧菌多克隆抗体的制备方法:用体积分数0.05%甲醛于30℃灭活副溶血弧菌4 h制备抗原,并将此抗原分多次,以不同剂量免疫新西兰大白兔获得特异性多克隆抗体,以山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗,通过间接ELISA法测定其多克隆抗体的效价、敏感性和特异性。结果表明:在免疫的第5周产生大量高效价抗体,效价最高可达1.6×105;此多克隆抗体对副溶血弧菌检测灵敏度为1×105CFU/mL;交叉反应和阻断试验结果显示,此多克隆抗体具有很强的特异性。     

基于NOTA的重金属铅人工抗原的合成与鉴定

为研究杂环类双功能螯合剂在重金属人工抗原制备方面的效果,选取2-S-(4-氨基苯)-1,4,7三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(P-NH2-Bn-NOTA)和重金属铅为研究对象,以NOTA为双功能螯合剂,采用戊二醛法将重金属铅分别与载体蛋白BSA和OVA偶联制备人工抗原,经测定其结合比分别为9∶1和7∶1。以免疫原免疫兔子制备高效价的多克隆抗体并建立ic-ELISA,其回归方程为y=12.127ln(x)-11.386(R2=0.9961),IC50和IC20分别为157.89,13.30 ng/mL,说明制备的多抗具有较高的检测灵敏度。交叉反应试验显示:除了与镉交叉反应率为12.3%外,该抗体与重金属铁、铜和锌的交叉反应率均小于5.3%,具有较好的特异性。本研究成功制备了重金属铅人工抗原及多克隆抗体,采用杂环类双功能螯合剂制备的重金属人工抗原效果较好,为下一步开展杂环类双功能螯合剂在重金属人工抗原中的应用提供依据。     

副溶血弧菌的磁珠捕获及检测

建立结合免疫磁珠和PCR快速检测副溶血性弧菌的新方法.本研究选用副溶血弧菌作为抗原免疫日本大耳兔制备了多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价.利用辛酸硫酸铵沉淀结合逆向吸附对多抗血清进行纯化,经SDS-PAGE和斑点杂交检测验证纯化后抗体的特异性.将纯化后的抗体偶联于羧基化修饰的纳米磁珠表面,用来进行菌体的捕获.结果表明,抗体的效价达到106,纯化获得只与副溶血弧菌发生反应的高纯度抗体.制备的免疫磁珠捕获率在55％ ～70％之间,且稳定性较好,盐离子浓度(3.5％ NaCl、4.5％ NaCl)对捕获率的影响不大,在pH5～9之间,磁珠捕获差异也较小.在对纯培养物的检测实验中,本方法最低检测限为102cfu/mL;而在鱼肉糜样本中的检测限为103cfu/mL,且样品中高浓度杂菌的存在不影响检测灵敏度.免疫磁珠结合PCR用于副溶血性弧菌的检测具有很高的灵敏度和特异性,具有广阔的前景.     

小麦球蛋白单克隆和多克隆抗体制备及建立酶联免疫吸附法快速检测技术

目的建立小麦球蛋白的ELISA检测技术,用于蛋白质掺假以及过敏原成分的快速检测。方法从麦胚粉中提取球蛋白,抗原免疫Balb/c小鼠进行4次免疫后,通过脾脏细胞杂交瘤技术及间接ELISA筛选制备单克隆抗体,同时制备兔抗小麦球蛋白的多克隆抗体。通过棋盘滴定法,初步确定单克隆抗体和多克隆抗体的最佳工作浓度,建立双抗夹心ELISA。结果通过免疫和杂交瘤技术获得了抗小麦球蛋白的单克隆抗体,纯化后抗体的效价均达到1:107,通过免疫兔制备的多克隆抗体经纯化后效价在1:2.4×105左右,所建立的双抗体夹心ELISA方法最低检测限为10 ng/m L,与其他物种的蛋白不发生交叉反应。结论本文建立的双抗体夹心ELISA方法具有良好的特异性和灵敏度,为建立乳品中小麦成分掺假及过敏原成分快速检测提供理论依据。     

鲤鱼小清蛋白多克隆抗体的制备及免疫交叉反应的研究

小清蛋白是鱼类的主要过敏原,对小清蛋白的抗原性研究将有助于进一步深入理解淡水鱼过敏原在致敏过程中的免疫学意义。以鲤鱼为原材料,首先纯化出鲤鱼小清蛋白,再制备兔抗鲤鱼小清蛋白多克隆抗体,采用间接ELISA法测定抗体效价和抑制性ELISA法测定其特异性,然后采用免疫印迹法及抑制性ELISA法研究鲤鱼与青鱼、草鱼、鲢鱼之间的免疫交叉反应。结果表明,实验兔对鲤鱼类小清蛋白发生了高强度的免疫应答,应答多克隆抗体效价可高达720000,并且4种鱼类小清蛋白在12 ku处发生了强烈的免疫交叉反应。     

西地那非多克隆抗体的制备及特异性分析

目的为了研究开发一种具有高灵敏度、高特异性的西地那非(sildenafil,SD)多克隆抗体。方法本文通过人工合成西地那非半抗原(SDH)和西地那非抗原(SDH-BSA),然后经免疫兔子,制备了SD多克隆抗体,并对制得的抗体的特异性进行了分析。结果免疫后产生了SD多克隆抗体,抗体的效价为3.8×105,线性检测范围为0.02~3.8 ng/m L,抗体除与瓦地那非具有较高的交叉反应率外,与红地那非、他地那非等结构类似物交叉反应率均较低。结论采用本方法制备的SD多克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度,可用于SD快速检测试剂盒的开发。     

Development and Characterization of Monoclonal and Polyclonal Antibodies Against Salmonella enterica Typhimurium for Biosensor Detection

ABSTRACT: For the construction of a biosensor to specifically and effectively detect Salmonella enterica Typhimurium, a monoclonal antibody (mAb) 1B4 and a polyclonal antibody (pAb) S48 were developed against purified outer membrane proteins (OMPs) of Salmonella enterica Typhimurium. Gel electrophoresis data indicated that the apparent molecular weight of the main OMP was 55 kD. The mAb 1B4 strongly reacted to Salmonella enterica Typhimurium and Salmonella enterica Paratyphi and had no cross-reaction to other gram-negative and gram-positive bacteria that were tested. The pAb S48 also showed high reactivity to Salmonella enterica Typhimurium, but had cross-reactivity with other tested bacteria. Because of the high specificity and sensitivity of 1B4 against S. enterica Typhimurium, it was immobilized onto a sensor platform to capture bacteria. The captured bacteria were visualized byalight microscope fortheir detection. The detection limit of the biosensorwas 1 × 10² colony forming units/mL in bacterial culture and in a milk sample, and no other bacteria interfered with the binding of targeted cells. Therefore, a biosensor was developed that would rapidly detect Salmonella in the laboratory and in a food processing plant.     

国产沙门氏菌免疫磁珠的制备及其应用

目的优化免疫磁珠制备条件,获得捕获性能高、成本低的国产沙门氏菌免疫磁珠,为国产沙门氏菌免疫磁珠的产业化制备奠定基础。方法采用亚微米级羧基磁珠及沙门氏菌多克隆抗体,利用碳二亚胺缩合法制备2 mg级免疫磁珠。以目标菌捕获率、磁珠表面抗体偶联率为评价指标,对4种粒径(100、300、500、1000 nm)的磁珠原材料进行筛选;以目标菌捕获率、磁珠表面抗体偶联率、免疫磁珠表面FITC荧光强度为评价指标,对磁珠与抗体不同的投料比(100:1、100:1.5、100:2、100:2.5、100:3)进行优化;同时,对国产沙门氏菌免疫磁珠与进口免疫磁珠(Dynalbeads~?沙门氏菌免疫磁珠、Bac Trace~?沙门氏菌免疫磁珠)的性能进行比较分析,考察了捕获率、免疫磁珠与目标菌的结合情况、特异性捕获能力等,并在实际样品中进行了应用检测。结果以粒径为300 nm的磁珠为原材料制备的免疫磁珠对浓度为10~2 CFU/mL的目标菌的捕获率为99%、抗体偶联率为34.64%,明显高于其他粒径的免疫磁珠;当投料比为100:2(磁珠:抗体)时,制备的免疫磁珠对浓度为10~2 CFU/m L的目标菌的捕获率为100%,偶联率为52.34%,优于其他投料比;针对不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌(10~0~10~6 CFU/mL),国产免疫磁珠的捕获率高于进口免疫磁珠(国产:83%~100%;Dynalbeads~?:57%~74%;Bac Trace~?:9%~40%);在25 mL牛奶中添加(11.9±3.7)CFU鼠伤寒沙门氏标准菌株,国产沙门氏菌免疫磁珠的检出率高于进口免疫磁珠(国产:100%;Dynalbeads~?:70%;Bac Trace~?:40%)。结论优化了制备条件后所制备的国产沙门氏菌免疫磁珠的捕获能力强、价格低、能够实现大体积实际样品中痕量目标菌的100%检出,具有广阔的应用前景,本研究为沙门氏菌免疫磁珠的国产化应用提供了科学数据。     

大肠杆菌O157:H7胶体金试纸条的研制

采用胶体金标记抗大肠杆菌O157:H7 单克隆抗体(鼠源),通过将大肠杆菌O157:H7 多克隆抗体和驴抗鼠抗体(二抗)喷涂于硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,研制大肠杆菌O157:H7 胶体金快速检测试纸条。通过优化实验,确定最佳条件为标记量16.8μg/mL、标记pH8.0、封闭剂PEG20000、检测时样品最佳pH7.0～7.5。对26 株常见细菌交叉反应结果表明,该试纸条除与鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311 和金黄色葡萄球菌CMCC 26003 有轻微交叉反应外,与其他24 株菌均无交叉反应。该试纸条灵敏度为104CFU/mL。用该试纸条检测大肠杆菌O157:H7操作简便、快捷、灵敏度高、特异性强。     

Hen Egg Yolk Prevents Bacterial Adherence: A Novel Function for a Familiar Food

ABSTRACT: The aim of this study was to evaluate the ability of unfractionated hen egg yolk to prevent the attachment of Salmonella typhimurium to murine intestinal epithelial cells in vitro. Inhibition of adherence was examined microscopically and by an ELISA. Both methods showed that egg yolk from immunized and unimmunized hens significantly reduced bacterial adherence. Optical density (OD) readings ± SD of 0.825 ± 0.016 for untreated bacteria were reduced to 0.335 ± 0.024 and 0.267 ± 0.021 for bacteria pretreated with egg yolk from immunized hens and unimmunized hens, respectively. Microscopic analysis showed that egg yolk from either immunized or unimmunized hens reduced bacterial adherence from 17 ± 2.7 bacteria per epithelial cell to less than 4 bacteria per epithelial cell. These results show that hen egg yolk significantly inhibits adherence of S. typhimurium to intestinal epithelial cells in vitro. Boosting of specific antibody levels does not enhance this antiadhesive effect, suggesting that egg yolk contains novel antiadhesive factors.     

鼠伤寒沙门氏菌ompc基因PCR的检测方法

建立一种鼠伤寒沙门氏菌的聚合酶链式反应检测方法。根据GenBank中已发表的鼠伤寒沙门氏菌的ompc的基因序列,设计和合成了一对特异性引物,并优化了反应条件,检测了该方法的敏感性和特异性。结果成功扩增出了鼠伤寒沙门氏菌470 bp的ompc特异性基因片段,而对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和志贺氏菌4 种食品中常见的病原菌均未扩增出相应片段。敏感性实验结果表明本方法可检测到最低1 pg/μL的鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA。     

基于pH响应聚合物的比色法检测牛奶中的鼠伤寒沙门氏菌

目的 基于pH响应聚合物构建一种用于检测牛奶中鼠伤寒沙门氏菌的比色传感器。方法 通过溶剂诱导法,使用酚酞、适配体、牛血清白蛋白制备pH响应聚合物,基于适配体对鼠伤寒沙门氏菌的特异性结合与pH响应聚合物遇碱释放酚酞的比色反应建立鼠伤寒沙门氏菌比色检测方法,优化反应条件,并将其用于检测牛奶。结果 该传感器在鼠伤寒沙门氏菌菌液浓度10²～10⁷ CFU/mL范围内与吸光度呈现良好的线性关系,线性系数为0.982,检出限可达52 CFU/mL。将此法用于牛奶中鼠伤寒沙门氏菌的检测,加标回收率为83.2%～102.0%。结论 该方法操作简便、结果可视化,为牛奶中鼠伤寒沙门氏菌的快速检测提供了一种新思路。     

免疫磁珠-环介导等温扩增快速检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌

建立免疫磁珠分离（immunomagnetic separation,IMS）联合环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术检测牛肉中鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌的方法。用生物素标记的鼠伤寒沙门氏菌抗体和生物素标记的金黄色葡萄球菌菌体蛋白抗体对链霉亲和素磁珠进行功能化,从牛肉中捕获和分离目标致病菌。结果表明：经优化后,每毫克磁珠与10 μL鼠伤寒沙门氏菌抗体偶联,400 μL鼠伤寒沙门氏菌免疫磁珠在45 min内对104 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌的捕获率为52.16%;每毫克磁珠与6 μL金黄色葡萄球菌抗体偶联,300 μL金黄色葡萄球菌免疫磁珠在30 min内对104 CFU/mL金黄色葡萄球菌的捕获率为56.80%;建立的IMS-LAMP方法特异性高,对牛肉中鼠伤寒沙门氏菌的检测灵敏度为1.2×103 CFU/mL,对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为4.4×104 CFU/mL;富集5 h后,鼠伤寒沙门氏菌的检测限可至1.2 CFU/mL,富集7 h后,金黄色葡萄球菌的检测限可降至4.4 CFU/mL。建立的IMS-LAMP方法用时短,灵敏度高,操作简单,可以有效检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。     

Antigenic homology of endotoxin with a coliform mastitis vaccine strain, Escherichia coli O111:B4 (J5).

This study examined recognition of heterologous Gram-negative endotoxin by antibodies recognizing common lipopolysaccharide core antigens. Gram-negative endotoxins from 11 heterologous bacterial strains were tested for recognition by antibodies against common lipopolysaccharide core antigens. Serum was harvested from a calf immunized with the Rc mutant, Escherichia coli O111:B4 (J5), and affinity purified against endotoxin derived from an Ra mutant, Salmonella typhimurium, producing an antibody reagent recognizing homologous Gram-negative core antigens present in the Rc mutant vaccinal antigen. This reagent demonstrated reactivity against 11 chemically purified Gram-negative endotoxins. Included were endotoxins derived from 3 smooth E. coli species, 2 Salmonella spp., Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, and lipid A. Endotoxin derived from K. pneumoniae had significantly higher ELISA reactivity with core antigen specific antibodies than did endotoxin derived from either E. coli O111:B4 (J5) or P. aeruginosa. These results suggest immunization with R mutant bacterins may have utility in the prevention of Gram-negative mastitis even when whole bacteria react poorly with antibodies recognizing common core antigens.     

基于荧光微球的免疫层析法结合免疫磁珠分离技术快速定量检测鼠伤寒沙门氏菌

为了建立一种能快速、灵敏、特异检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,ST)的方法,本研究以荧光微球(FM)为标记物建立了荧光微球免疫层析检测法(FM-ICA),将羧基化的磁性微球与抗体偶联制备了抗-ST免疫磁珠(IMB),并将FM-ICA与IMB联合用于富集和检测三种食品样本中的ST。在优化条件下,FM-ICA检测的线性范围为3.16×10~6~2×10~9 CFU/m L,回收率为80%~120%,变异系数均小于5%。当菌液浓度大于1×10~8 CFU/m L时,结果显示与同属沙门氏菌的交叉反应;而当菌液浓度小于或等于1×108CFU/m L时,常见的12株非目标菌检测结果为阴性,特异性较好。FM-ICA+IMB联合检测三种模拟食品时的回收率为38%~55%,其中,西红柿对回收率影响较小,鸡蛋和猪肉影响较大。然而,联合检测的灵敏度可达到1×10~5 CFU/m L,比单一FM-ICA方法提高了30倍,同时,整个检测过程可在2 h内完成。本检测方法的建立对于快速筛查鼠伤寒沙门氏菌具有重要意义。