醇析法结合离子交换法提取分离卵转铁蛋白

乙醇析出法结合两步弱酸性阳离子交换层析可有效地从鸡蛋清中分离纯化卵转铁蛋白,结果表明:预处理后黏度降低的蛋清经两步醇析法(45%浓度乙醇沉淀杂蛋白、59%乙醇浓度沉淀获得OVT粗品),再经两步阳离子层析法(第一步:pH8.0,20 mmol/L磷酸盐缓冲液平衡,含0.5 mol/L NaCl的pH8.0,20 mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱;第二步:pH5.2,10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡,含0.5 mol/L NaCl的pH5.2,10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液洗脱)可得到纯度较高的卵转铁蛋白;SDS-PAGE电泳检测终产品的纯度大于96%。     

茶花水溶性蛋白的分离纯化及其体外吸附胆酸盐能力的研究

通过采用硫酸铵盐析法、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析法提取分离制备茶花水溶性蛋白,并通过磷酸盐缓冲液pH值的最佳选择改善分离提纯效果。同时在体外模拟人体消化环境,通过体外吸附胆酸盐能力的测定证实所提取分离得到的茶花水溶性蛋白具有一定的降血脂功能。结果发现:当磷酸盐缓冲溶液pH值为5.0于室温下洗脱的效果最好,得到的3个主要分离组分中峰Ш的体外吸附胆酸盐能力最佳,其对胆酸钠,甘氨胆酸钠,牛磺胆酸钠的吸附量分别为0.78 0.02、0.64 0.00、1.60 0.02 mol/mL。     

苦荞水溶性蛋白体外吸附胆酸盐能力的研究

通过采用硫酸铵盐析法、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析法提取分离制备苦荞水溶性蛋白,并通过磷酸盐缓冲液pH值、动态层析流速的最佳选择改善分离提纯效果。同时通过体外吸附胆酸盐能力的测定证实所提取分离得到的苦荞水溶性蛋白具有一定的降血脂功能。结果发现：当磷酸盐缓冲溶液pH值为6.5、流速1.0mL/min于室温下洗脱的效果最好,得到的3个主要分离组分中峰3的体外吸附胆酸盐能力最佳。     

菊粉酶分离纯化方法的研究

探究了Sephadex凝胶层析法和DEAE-纤维素离子交换层析法分离纯化菊粉酶的条件。结果显示,用SephadexG-75凝胶层析分离菊粉酶,经pH4.7 0.01 mol/L的NaAC-HAC缓冲液洗脱,得到2个洗脱峰,仅SⅠ峰有酶活力,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)电泳检测SⅠ峰有4条蛋白带,SⅡ峰有1条带,较粗酶液提纯4.7倍,酶活回收率60.8%;用DEAE-纤维素离子交换层析分离,pH6.0,0.01 mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液平衡,用含0~0.5 mol/L NaCl的洗脱液线性梯度洗脱,得7个洗脱峰,仅DⅡ峰有酶活力,用PAGE检测该活力峰只有1条蛋白带,达到电泳纯,较粗酶液提纯11.2倍,酶活回收率55.1%。     

鼠伤寒沙门氏菌特异性多克隆抗体的纯化方法

以福尔马林灭活的鼠伤寒沙门氏菌免疫雌性日本大耳兔,制备抗沙门氏菌的多克隆抗体。分别通过辛酸-硫酸铵沉淀法、磁珠偶联抗原吸附法纯化抗体,所制备的抗体效价为3.2×105,纯度较高,但交叉反应现象较严重。本实验以杂菌抗原反向吸附法纯化抗体,有效消除了抗体与杂菌的交叉反应,初步建立了一种高特异性多克隆抗体的纯化方法。     

莲藕多糖的分离纯化及抗氧化活性研究

本实验从莲藕渣中通过水提醇沉法提取得到水溶性莲藕粗多糖NPh,采用DEAE Sephrose Fast Flow离子交换层析法纯化NPh,实验不同pH值及盐浓度对NPh的洗脱效果,确定了合适的纯化条件为以pH5.0 0.05mol/L HAc-NaOAc缓冲液作为起始缓冲液,起始缓冲液加0.5mol/L NaCl进行分步洗脱,洗脱速度为6.0ml/min,收集得到均-多糖组分NPhz.通过清除DPPH·自由基和保护红细胞氧化溶血的实验研究NPh2的抗氧化活性,结果显示,NPh不存在清除DPPH·自由基的作用,能够有效抑制红细胞氧化损伤.     

鲢鱼背肌组织蛋白酶L的初步分离及蛋白层析纯化方法

研究鲢鱼背肌中组织蛋白酶L的初步分离和纯化方法,重点研究初步分离过程中酸化处理条件、硫酸铵饱和度和透析袋分子质量对粗酶液中组织蛋白酶L活性的影响,以及纯化过程中不同类型离子交换层析柱和离子交换平衡缓冲液pH值对蛋白层析纯化的影响。结果表明:盐析最佳硫酸铵饱和度范围55%~90%,酸处理最优条件pH 3.0,40 ℃热处理10 min后pH值回调至6.0,透析袋最佳分子质量7 000 u。采用弱阴离子交换和分子筛两步层析法,选取20 mmol/L、pH 6.0磷酸盐缓冲液作为弱阴离子柱的平衡缓冲液,可得到45 ku电泳纯组织蛋白酶L,其纯化倍数为487,回收率为22 mg/1 000 g。本法可最大限度地去除杂蛋白且操作简便、回收率高,为探究鱼糜凝胶劣化现象的有效抑制方法奠定了良好的基础。     

阴离子交换树脂分离酪蛋白糖巨肽工艺条件优化

采用离子交换树脂从乳清粉中分离酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide,CGMP),筛选适于分离CGMP的离子交换树脂并考察静态吸附过程中吸附pH值、吸附时间、缓冲液浓度等因素对CGMP分离效果的影响。乳清粉溶液在pH5.1时离心除杂后与201×4树脂混合,吸附条件为吸附pH3.9、吸附时间1h、缓冲液浓度0.02mol/L、洗脱液为0.5mol/L pH4.0的氯化钠溶液、洗脱时间4h;100g乳清粉利用此工艺条件可得1.45g唾液酸含量10.4%(以蛋白质计)的CGMP。该工艺方法分离过程简单、纯化效果好、唾液酸含量高,适用于工业化生产。     

藏灵菇源克鲁维酵母M3菌株胆盐水解酶的分离纯化研究

为获得藏灵菇马克斯克鲁维酵母M3菌株胆盐水解酶(BSH)的纯品,探讨了BSH粗品的分离纯化方法.粗酶液采用硫酸铵分级沉淀,再以DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换介质,分别考察缓冲液pH值、流速和洗脱方式等对BSH分离纯化的影响.结果表明,在40%～70%饱和度的硫酸铵条件下BSH提取效率最高.最佳层析条件为采用pH值为6.5、50mmol/L磷酸钠缓冲体系、1.5mL/min的流速,进行分步洗脱(100mmol/L、350mmol/L、500mmol/L～600mmol/L NaCl及50mmol/L磷酸盐缓冲液3步洗脱).在优化纯化条件下BSH的比活力可达479.55AU/mg,是原粗酶液的23.66倍.     

新霉素免疫亲和柱的制备及其性能鉴定

目的制备新霉素多克隆抗体免疫亲和柱并鉴定其性能。方法将经过蛋白A柱纯化的新霉素多克隆抗体,非定向偶联于sepharose 4B琼脂糖凝胶,间接竞争ELISA方法检测抗体特异性、亲和常数及纯化前后效价;通过考马斯亮蓝法测定偶联前后蛋白浓度计算偶联率,高效液相色谱方法(HPLC)筛选亲和柱最优洗脱剂;将免疫亲和萃取技术与HPLC以离线方式联用测定南美白对虾中的新霉素。结果抗体纯化后效价提高5.67倍,亲和常数为2.02×10~8 L/mol;在4℃、6 h条件下可实现充分偶联;HPLC法筛选亲和柱最优洗脱剂为0.2 mol/L柠檬酸盐缓冲液(含0.5 mol/L NaCl,pH 2.3),平均回收率为104.57%±0.03%(n=6);重复使用5次,柱容量为初始柱容量的85%以上;储存于含有0.02%NaN_3的PBS平衡缓冲液中,110 d后800 ng加标回收率在75%以上;分别按照500、5000、7500μg/kg的浓度对南美白对虾进行加标,加标回收率依次为63.29%±5.30%、80.15%±6.27%、83.87%±0.88%;单个样本免疫萃取柱净化前处理时间较固相萃取缩短2~4 h。结论制备所得的亲和柱准确性高、重现性好,在食品安全检测中具有实际应用的潜力。     

基于纳米金电化学免疫传感器测定牛奶中的青霉素G

利用吸附法将青霉素G抗体固定于纳米金修饰的玻碳电极表面,制备用于检测青霉素G的电化学免疫传感 器,建立高度灵敏的一步直接电化学免疫法。纳米金的强吸附和导电作用,提高了青霉素G抗体的固定量和电化学 灵敏度。在优化条件下,该传感器的响应电流与青霉素质量浓度的对数在0.04～40.00 ng/mL范围内呈良好的线性关 系,相关系数为0.988 4,检测限为2.49 ng/mL,该法成功的实现了对牛奶中青霉素G的检测。     

间接竞争ELISA法检测呋喃唑酮代谢物

以人工抗原和特异性抗体为基础,建立了以2-硝基苯甲醛为衍生试剂检测呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)间接竞争ELISA方法。通过方阵滴定和间接竞争法确定ELISA方法的抗原抗体的最佳工作浓度;得到标准曲线的线性范围为0.25~10ng/mL,线性关系良好;根据标准曲线计算IC50为0.5881~1.1333 ng/mL。此外,检测了与其他类似物的交叉反应率,显示了很好的特异性;并且通过对虾样品添加回收率的测定,证明了该方法的准确性。高温短时间衍生化处理可达到与37℃孵育过夜同样的衍生效果。     

间接竞争酶联免疫法测定鱼体中的亚甲基蓝

目的 本实验旨在建立快速检测鱼体中亚甲基蓝的间接竞争酶联免疫分析方法。方法 以BSA载体蛋白,以天青C(Azure C)为半抗原,利用戊二醛法合成免疫原Azure C-BSA,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。通过对包被浓度、抗体浓度和二抗浓度等一系列实验条件的优化,建立检测鱼体中亚甲基蓝的间接竞争酶联免疫吸附方法(ic-ELISA)。结果 获得的多克隆抗体特异性强、灵敏度高,在5 -500 ng/mL范围内,线性良好,线性回归方程为y=0.3658x-0.1867 (R²=0.98),IC50为75.4 ng/mL,检测限为8.3 ng/mL,样品添加回收率为77.2%-79.3%,RSD为5.3 %-8.1 %。结论 该方法灵敏度高、特异性强,可用于鱼体中亚甲基蓝的快速检测。     

金磁微粒介导多克隆抗体纯化的最优化条件研究

将牛血清白蛋白(BSA)包被在自制的金磁微粒表面,以金磁微粒与抗体比例、反应时间、反应温度为主要影响因素,依据均匀设计表,对盐酸克伦特罗(CL)多克隆抗体进行纯化,并对纯化前后抗体的效价以及抗体对CL的检测灵敏度进行了研究。结果表明,金磁微粒与抗体的比例以及两者的反应时间是影响抗体纯化的主要因素;纯化后多克隆抗体中抗BSA抗体明显下降,而抗CL抗体基本保持不变;对比纯化前后CL的检测曲线,纯化后的最低检测限(LOD)和半抑制浓度(IC50)分别下降了6.90%和24.37%。     

Colloidal gold-based immunochromatographic test strip for rapid detection of abrin in food samples

In the present study, we developed a convenient, rapid, and sensitive immunochromatographic (IC) test strip to detect abrin in assay buffer and spiked abrin in test food samples. The abrin IC test strip was based on a sandwich format consisting of a monoclonal antibody and a polyclonal antibody. The anti-abrin A chain monoclonal antibody from mice was immobilized on a porous nitrocellulose membrane as a capture antibody, while the anti-abrin polyclonal antibody from rabbits was conjugated to colloidal gold particles, serving as a detection antibody. Both visual observation and quantitative analysis indicated that the lower detection of the strip was about 3 ng/ml when abrin was directly spiked into milk, orange juice, and drinking water at a concentration of 3 to 60 ng/ml; the analytical recovery rate was 92.2 to 128%. With this method, abrin spiked into food could be detected in less than 10 min. Moreover, the IC test strip showed no cross-reaction with the closely related phytotoxin ricin. Therefore, our test strip is an ideal candidate for the development of a kit for rapid and quantitative detection of abrin in food samples.     

基于Arah6的花生间接竞争ELISA检测方法的建立

建立了基于花生主要过敏原蛋白Arah6的间接竞争酶联免疫检测法,实现了对食物中花生的定量检测。利用花生过敏原Arah6纯品免疫新西兰大白兔,制得兔抗Arah6的多克隆抗体,以Arah6纯品作为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗,确定了包被抗原质量浓度为1μg/mL,一抗最佳稀释度为1:50000,酶标二抗稀释度为1:5000。此检测方法对Arah6的定量检测范围为16.5～10000ng/mL(折合成含花生的含量,约为165ng/mL～100μg/mL),抑制方程为抑制率I=21.418lgC-6.0633(C为Arah6的质量浓度,单位ng/mL),IC50为414.6ng/mL,相关系数R2=0.9989。该检测方法灵敏度高,检测范围广,适用于食品中花生现场快速检测。     

双抗夹心ELISA方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

采用0.5% 福尔马林灭活的单核细胞增生李斯特氏菌作为免疫原免疫日本大耳兔,获得抗单核细胞增生李斯特氏菌多克隆抗体,并以此多克隆抗体作为捕获抗体,以抗单核细胞增生李斯特氏菌Internalin A(InlA)单克隆抗体作为检测抗体,建立快速、特异的检测该菌的双抗夹心ELISA 方法。结果表明：该方法对单核细胞增生李斯特氏菌纯培养液的最低检测量为1.7 × 105CFU/mL。在检测食品样品的实验中,食品样本对本方法干扰较小,运用选择性增菌液进行前增菌可提高该方法的准确性。     

双歧杆菌免疫学检测方法的研究

建立双歧杆菌快速检测方法间接ＥＬＩＳＡ法．应用双歧杆菌细胞壁作为抗原所获得的抗血清,能够检测出双歧杆菌的最低浓度范围在１０５ｍＬ左右．在检测过程中无需纯化抗原．所建立的方法具有较强的特异性,能够有效地将两歧双歧杆菌与其它种属的微生物区别开来     

Double-antibody based immunoassay for the detection of β-casein in bovine milk samples

The concentration of casein (CN) is one of the most important parameters for measuring the quality of bovine milk. Traditional approach to CN concentration determination is Kjeldahl, which is an indirect method for determination of total nitrogen content. Here, we described a double-antibody based direct immunoassay for the detection of β-CN in bovine milk samples. Monoclonal antibody (McAb) was used as capture antibody and polyclonal antibody (PcAb) labelled with horseradish peroxidase (HRP) as detection antibody. With the direct immunoassay format, the linear range of the detection was 0.1–10.0 μg mL⁻¹. The detection limit was 0.04 μg mL⁻¹. In addition, the concentration of β-CN in real bovine milk samples has been detected by the developed immunoassay. There was a good correlation between the results obtained by the developed technique and Kjeldahl method from commercial samples. Compared to the traditional approach, the advantage of the assay is no need of time-consuming sample pretreatment.