M2型丙酮酸激酶同工酶表达对肝细胞癌化疗敏感性的影响

【摘要】 目的 研究M2型丙酮酸激酶同工酶（PKM2）对肝癌细胞HepG2增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响,探讨PKM2表达对肝细胞癌（HCC）化疗敏感性的影响。方法 采用蛋白印迹和实时定量聚合酶链反应（RT- qPCR）检测正常肝细胞株HL- 7702和肝癌细胞株HepG2中PKM2蛋白和mRNA表达。构建靶向PKM2基因重组质粒（PKM2- siRNA）和对照质粒（siRNA- NC）,并转染至HepG2细胞中,蛋白印迹和qRT- PCR检测PKM2敲低情况。细胞克隆形成、Transwell趋化和TUNEL法分析PKM2表达对细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。不同浓度多柔比星（DOX）处理各组细胞后,CCK- 8和TUNEL法检测细胞活性和凋亡。 结果 HepG2细胞株中PKM2蛋白和mRNA表达与HL- 7702相比显著上调[mRNA（1.01±0.01）%对（5.04±0.02）%,蛋白（1.34±0.04）%对（4.03±0.02）%,P＜0.05]。PKM2在PKM2- siRNA转染HepG2细胞中表达在转录和翻译水平显著降低,细胞克隆形成率、细胞侵袭数均低于空白转染组和转染siRNA- NC对照组,细胞凋亡率高于空白转染组和转染siRNA- NC对照组,DOX半抑制浓度（IC50）为7.25 μg/mL,转染siRNA- NC对照组为18.51 μg/mL。随着DOX给药浓度增加,细胞凋亡率显著增加。转染PKM2- siRNA细胞组凋亡数明显高于转染siRNA- NC对照组（P＜0.05）。 结论 PKM2在人肝癌细胞株HepG2中高表达。敲低PKM2表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,增强对DOX化疗敏感性。PKM2可能是HCC治疗的潜在靶点。

     

磷脂酰肌醇3激酶调节亚基1过表达对肝细胞癌进展的影响

【摘要】 目的 研究磷脂酰肌醇3激酶调节亚基1（PIK3R1）表达对肝细胞癌（HCC）进展的影响。 方法 免疫组化和逆转录- 定量聚合酶链反应（RT- qPCR）检测HCC组织中PIK3R1表达。RT- qPCR和免疫印迹检测不同HCC细胞系中PIK3R1 mRNA和蛋白表达,选择MHCC97H、HCCLM3细胞作为模型研究PIK3R1对HCC进展的影响。溴化噻唑蓝四氮唑（MTT）实验、克隆形成实验、划痕愈合实验和流式细胞术评价PIK3R1下调对HCC细胞增殖、迁移和凋亡的影响。蛋白印迹分析评估PI3K/蛋白激酶B（Akt）/mTOR信号传导通路的表达变化。 结果 HCC组织中PIK3R1表达与相邻正常组织相比,显著上调。下调PIK3R1表达抑制HCC细胞系增殖、迁移并促进其凋亡。PIK3R1下调还抑制MHCC97H、HCCLM3细胞中p- PI3K、p- Akt和p- mTOR表达。 结论 HCC中PIK3R1表达显著上调,沉默PIK3R1可抑制HCC细胞系增殖、迁移并加速凋亡,其可能是未来HCC治疗的潜在靶点。
     

动脉粥样硬化细胞模型建立及细胞内铁代谢紊乱初步研究

【摘要】 目的 建立动脉粥样硬化（AS）细胞模型,研究铁代谢与AS关系及AS斑块中巨噬细胞铁代谢紊乱的分子机制,为临床干预铁代谢及防治AS提供理论依据。方法 采用RAW264.7细胞,以氧化型低密度脂蛋白（ox- LDL）诱导制备泡沫细胞,油红O染色并通过酶联免疫法检测胞内脂质（总胆固醇、游离胆固醇）验证AS泡沫细胞模型建立。免疫印迹法检测铁代谢相关铁蛋白（FT）、膜铁转运蛋白（FPN）1,免疫组化、免疫荧光法检测和定位巨噬细胞中FPN1表达。结果 ox- LDL诱导制备的细胞质内有大量红色脂质颗粒,较多脂质融合成大油滴状,符合泡沫细胞形态特征;泡沫细胞内有大量脂质堆积,胆固醇酯（CE）占比明显高于正常细胞（P＜0.05）;与正常对照组相比,泡沫细胞内FT含量明显高于正常细胞,FPN1含量增加且主要存在于细胞质内。结论 泡沫细胞中铁代谢紊乱,细胞内大量聚集。FPN1非细胞膜定位阻止铁从巨噬细胞中有效排出并加重泡沫细胞中铁累积,可能加剧AS斑块形成和发展。
     

冷冻消融后残存肿瘤与上皮-间质转化关系的实验研究

【摘要】 目的 探究不完全冷冻消融对前列腺癌RM- 1细胞生物学行为的影响及其产生机制。方法前列腺癌RM- 1细胞放入-20℃冰箱中冷冻5 min,37℃水域复温,待细胞状态恢复后重复冷冻10 min、15 min。培养1 d后镜下观察细胞形态。20只C57/BL小鼠构建荷瘤模型,随机分为对照组与不完全冷冻消融组。不同时间点测量肿瘤大小,14 d时处死小鼠、取肺组织行HE染色,统计肿瘤肺转移枚数。Transwell法检测细胞迁移及侵袭能力变化,免疫印迹检测相关蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测细胞上清液转化生长因子（TGF）- β分泌量。结果 经不完全冷冻消融的RM- 1细胞排列紊乱,形态发生改变,可有触角结构形成。术后3、7 d不完全冷冻消融组肿瘤体积略小于对照组,但仅术后7 d差异有统计学意义（P=0.019）,术后10、14 d肿瘤体积基本相等。不完全冷冻消融组肿瘤肺转移枚数明显多于对照组（P＜0.001）。Transwell试验显示不完全冷冻消融组细胞迁移及侵袭能力强于对照组（P＜0.05）。免疫印迹检测显示,不完全冷冻消融组与对照组相比,N- cadherin、MMP- 9、vimentin、表达上调,E- cadherin表达下调。ELISA检测结果显示,不完全冷冻消融组细胞上清液中TGF- β分泌增多。结论 不完全冷冻消融可使RM- 1细胞迁移及侵袭能力增强,增加荷瘤小鼠肿瘤肺转移枚数,影响上皮-间质转化相关蛋白表达。

     

冠状动脉雷帕霉素涂层支架植入术后支架内再狭窄临床预测因素探讨

【摘要】 目的 分析氧化型低密度脂蛋白（ox- LDL）、同型半胱氨酸（Hcy）与冠状动脉支架内再狭窄（ISR）的关系,探讨雷帕霉素涂层支架植入后ISR临床预测因素。方法 入选400例冠状动脉雷帕霉素涂层支架植入患者,根据冠状动脉复查造影结果分为ISR组和无ISR组。术前及复查造影时检测血浆ox- LDL、Hcy水平。采用多元Logistic回归分析评价ISR相关临床参数、血管造影特征及手术相关因素。结果 ISR组48例,无ISR组352例,临床ISR发生率为13.6%。与无ISR组比较,ISR组患者支架植入术前、冠状动脉复查造影时血浆ox- LDL、Hcy水平明显升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。多元Logistic回归分析结果显示,伴高血压病、伴糖尿病、Hcy、ox- LDL、服用他汀类药物、吸烟、冠状动脉开口病变、冠状动脉分叉病变、慢性完全闭塞病变、参考血管直径、术前血管狭窄程度、植入支架直径、植入支架长度为ISR独立相关因素。结论 冠状动脉雷帕霉素涂层支架植入后ISR并不少见。伴高血压、伴糖尿病、Hcy、ox- LDL、吸烟、冠状动脉开口病变、冠状动脉分叉病变、慢性完全闭塞病变、术前血管狭窄程度、参考血管直径、植入支架直径、植入支架长度为ISR独立相关因素。长期规律服用他汀类药物可降低ISR风险。
     

热损伤对肝细胞肝癌细胞增殖及侵袭转移特性影响的实验研究

【摘要】 目的 体外实验评价热损伤对肝细胞肝癌（HCC）细胞增殖、侵袭转移能力及上皮-间质细胞转化（EMT）等特性的影响,探索热消融与HCC复发转移之间的关系。方法 通过体外加热构建McA- RH7777 HCC细胞热损伤模型。CCK- 8法检测热损伤对HCC细胞增殖能力的影响,流式细胞技术检测细胞周期情况。Transwell实验研究热损伤对HCC细胞侵袭能力的影响。荧光定量-聚合酶链反应（RT- PCR）和蛋白印迹（Western blot）分析热损伤对HCC细胞侵袭及EMT 相关分子标志物VEGF、MMP- 9、Nm23、E- cadherin、vimentin的mRNA和蛋白表达的影响。结果 McA- RH7777 HCC细胞热处理条件为43.5℃水浴30 min。热处理后2～5 d细胞增殖能力显著高于对照组（P＜0.05）。热处理48 h及72 h后处于G1期细胞比例降低,S＋G2期细胞比例增加,差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较,热处理后24 h后HCC细胞侵袭能力差异不明显,而热处理72 h后细胞侵袭能力显著增加（22.3±2.46对14.2±1.82,P＜0.001）。RT- PCR和蛋白印迹分析结果显示,热处理72 h后HCC细胞VEGF、MMP- 9和vimentin表达水平显著增加,E- cadherin表达显著降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 亚致死量热损伤诱导McA- RH7777 HCC细胞发生EMT并增加其增殖和侵袭转移能力,表现出更高的恶性潜能。

     

鞣花酸经活性氧与血管再生途径对四氯化碳诱导肝硬化的保护作用研究

【摘要】 目的 研究鞣花酸（EA）对四氯化碳（CCl4）诱导的肝硬化小鼠模型的保护作用,并探讨其作用机制。方法 将40只小鼠随机分为对照组（n=10,予0.9%氯化钠溶液）和肝硬化模型组（n=30,由橄榄油稀释10%CCl4诱导建模）,模型组又随机分为EA未干预组（n=10）、7.5 mg/kg EA组（n=10）、15 mg/kg EA组（n=10）。检测所有小鼠血清谷氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和白蛋白（ALB）水平,苏木精-伊红（HE）染色观察肝细胞形态。采用逆转录-聚合酶链反应（RT- PCR）检测肝细胞Ⅰ型胶原蛋白mRNA水平,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH- PX）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase）- 3活性,蛋白印迹检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、VEGF受体（VEGFR）- 2表达水平。结果 根据肝细胞ALT、AST、ALB含量检测及HE染色细胞形态观察结果,推测EA对CCl4诱导的肝硬化小鼠具有保护作用。EA能显著抑制Ⅰ型胶原和iNOS表达,氧化应激及活性氧（ROS）形成显著降低,EA干预组VEGF、VEGFR- 2表达及caspase- 3活性显著提高。结论 EA通过ROS及血管再生途径对CCl4诱导的肝硬化有保护作用。
     

微小RNA- 155通过Notch信号通路对脑缺血-再灌注损伤的影响

【摘要】 目的 探讨微小RNA（miR）在小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）所造成缺血-再灌注（I- R）损伤中的调控作用。方法 构建C57BL/6小鼠MCAO模型,采用氯化三苯四氮唑（TCC）染色和神经功能评分了解脑I- R损伤对小鼠神经功能的影响。实时定量聚合酶链反应（RT- qPCR）技术检测miR- 155表达,苏木精-伊红（HE）染色观察miR- 155对脑组织病理学的影响,伊文氏蓝（EB）和脑组织含水量检测观察miR- 155对血脑屏障（BBB）通透性的影响,一氧化氮（NO）含量和内皮型内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达检测评估miR- 155对血管内皮细胞功能的影响,免疫印迹法检测Notch1、Notch1胞内结构域（NICD）、Jagged1和Hes1表达, RT- qPCR检测Notch1和Hes1 mRNA水平,以明确miR- 155在Notch信号通路中的作用。结果 miR- 155缺失提高Notch1、NICD、Hes1表达,降低脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）染色阳性细胞百分比和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase）- 3水平;干扰miR- 155表达增加NO产生和eNOS表达,导致脑组织含水量和EB含量下调。miR- 155过度表达使所有这些改变恢复至脑I- R损伤水平。Notch1、NICD、Hes1表达减轻脑I- R损伤状态。结论 miR- 155可通过Notch信号通路阻断正常NO产生和eNOS表达,这一调控机制可能是未来缺血性脑卒中治疗潜在靶点之一。

     

碘离子调控血管内皮细胞迁移机制研究

【摘要】目的研究碘离子(I－)对血管内皮细胞(VEC)迁移及细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)表达的影响,探讨细胞迁移与Budd-Chiari综合征隔膜形成机制。 方法将体外培养的VEC分为空白对照组和不同I－浓度实验组,用Transwell法检测各组细胞迁移数、I－与Cdc42抑制剂ML141作用后VEC迁移情况。采用Western blot技术检测不同I－浓度培养环境中Cdc42表达。 结果一定浓度的I－可以促进VEC迁移(P＜0.05);ML141可抑制VEC迁移;100 μg/L I－组、300 μg/L I－组、500 μg/L I－组VEC Cdc42相对表达量高于其它各组(P＜0.05)。 结论碘能促进VEC迁移,该效应可能与调整Cdc42表达有关。

     

体外不完全射频消融后肝癌细胞上皮-间质转化相关长链非编码RNA差异表达

【摘要】 目的 研究上皮-间质转化（EMT）相关长链非编码RNA（LncRNA）在不完全射频消融（RFA）肝细胞癌（HCC）病灶的差异表达谱变化。方法 采用Huh7细胞47℃水浴加热,获取体外模拟的不完全RFA HCC细胞。镜下及免疫印迹检测Huh7- H细胞EMT改变,Transwell检测细胞迁移与侵袭能力,CCK- 8检测细胞增殖能力。采用LncPathTM Human EMT Array芯片分析Huh7- H和Huh7差异表达的EMT相关LncRNA,RT- PCR验证。结果 镜下显示Huh7- H呈现EMT形态学改变。免疫印迹检测显示Huh7- H细胞上皮表型标志分子E- cadherin表达降低,间质表型标志分子N- cadherin、vimentin表达增加。Transwell迁移及侵袭实验显示,Huh7- H、Huh7穿膜细胞数分别为（138.0±11.8）和（61.0±5.2）、（82.7±39.4）和（33.3±7.8）,Huh7- H细胞迁移及侵袭能力明显增强（P＜0.05）。CCK- 8检测显示Huh7- H细胞增殖能力明显增强（P＜0.05）。LncPathTM Human EMT Array芯片筛选出3个差异表达LncRNA（P≤0.05,变化倍数≥1.5）,即2条LncRNA（FUNDC2P4、RPL27P7）下调,1条LncRNA（MTND4LP14）上调。RT- PCR验证HUH7- H组FUNDC2P4、RPL27P7、MTND4LP14基因表达丰度分别是HUH- 7组的0.137、0.869、1.037倍。临床标本验证LncRNA FUNDC2P4在癌旁组织表达高于HCC组织,HCC组织高于RFA术后残余HCC组织。结论 筛选出不完全RFA后HCC细胞低表达的EMT相关LncRNA FUNDC2P4,为深入探讨该基因功能及分子机制提供了基础。