结核分枝杆菌融合蛋白亚单位疫苗对BCG初始免疫的加强效应及保护效力

目的探讨结核分枝杆菌融合蛋白亚单位疫苗对BCG初始免疫的加强效应及保护效力。方法将Ag85B、Ag85B-Mpt64190-198-HspX(AMH)、Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4(AMM)以及AMH+AMM蛋白分别与佐剂二甲基三十六烷基铵(DDA)和卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)混合,制备亚单位疫苗。第0周用BCG皮下免疫C57BL/6小鼠,第8、10周分别用各蛋白疫苗皮下加强免疫,以PBS和BCG(仅免疫1次)作为对照。末次免疫后4周,采血检测血清抗体水平,并分离脾淋巴细胞,检测分泌IFNγ的水平;末次免疫后12周,经尾静脉注射H37Rv株,6周后取肺,进行菌落计数,抗酸及HE染色观察。结果各亚单位疫苗加强组诱导产生的特异性抗Ag85BIgG抗体水平均明显高于BCG组;融合蛋白疫苗加强组免疫小鼠脾细胞经Ag85B和PPD刺激后,产生分泌IFNγ的淋巴细胞数明显多于BCG组;融合蛋白加强组免疫小鼠肺组织结核结节面积与BCG组比较,差异无统计学意义;仅AMM+AMH加强组免疫小鼠肺组织菌落计数明显低于BCG组,其抗酸染色阳性细菌数明显低于PBS、BCG及AMH、Ag85B加强组。结论AMH和AMM疫苗联合加强BCG免疫,能诱导小鼠特异性的细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性,可增强BCG的保护效力。     

不同储存条件对结核亚单位疫苗参考品免疫原性的影响

目的评价不同储存条件对结核亚单位疫苗参考品(简称参考品)免疫原性的影响。方法按以下抗原与佐剂比例配制1人份疫苗参考品:[10μg Ag85b蛋白+10μg EC蛋白+50μg Ploy IC+0.2 mg Al(OH)3]/0.2 ml。将疫苗参考品于-70及4℃分别保存1、6、9、12个月,并于每个时间点免疫BALB/c小鼠,实验分4组:PBS组、冷藏组(4℃保存参考品)、冻存组(-70℃保存参考品)及现配组,均经小鼠后肢内侧肌肉注射,0.2 ml/只,共免疫3次,每次间隔10 d,末次注射10 d后,收集小鼠脾淋巴细胞,并经眼球采血,分离血清。ELISPOT法检测抗原特异性的IL-2、IFNγ水平,CCK-8法检测细胞增殖水平,间接ELISA法检测血清Ig G抗体效价。结果经Ag85b和EC刺激,现配组各月间的斑点形成细胞数(spot forming cells,SFCs)及脾细胞增殖指数(stimulating indox,SI)差异无统计学意义(P0.05),且均显著高于PBS组(P0.05),表明免疫学检验模型成立且稳定,各试验组与现配组结果具有可比性。经4℃冷藏12个月,参考品的Ag85b及EC特异性IL-2、IFNγ相对水平及脾淋巴细胞相对增殖水平均显著低于冷藏1个月的参考品(P0.01),经-70℃冻存12个月,参考品的Ag85b、EC特异性IL-2、IFNγ相对水平及脾淋巴细胞相对增殖水平与冻存1个月的参考品差异无统计学意义(P0.05)。与现配组比较,冷藏组及冻存组Ag85b和EC特异性抗体水平相对平稳,各月间差异均无统计学意义(P0.05),且两组间差异无统计学意义(P0.05)。结论 -70℃冻存12个月内的参考品的细胞及体液免疫水平均未明显降低,可作为该参考品的长期保存条件。不同保存条件对疫苗免疫保护力的影响需进一步考察。     

氢氧化铝和PolyIC佐剂在结核亚单位疫苗中的佐剂效应

目的观察重组抗原Ag85b和ESAT6-CFP10(EC)联合氢氧化铝佐剂(Al)和PolyIC(IC)佐剂诱导小鼠的免疫效果及对豚鼠结核的预防作用。方法将BALB/c小鼠随机分为6组:PBS组、Pro组(Ag85b+EC)、Al+IC组、Pro+Al组(Ag85b+EC+Al)、Pro+IC组(Ag85b+EC+IC)、Pro+Al+IC组(Ag85b+EC+Al+IC),经小鼠后肢内侧肌肉注射,共注射3次,间隔10 d。末次注射后2周,摘眼球采血,分离血清,采用间接ELISA法检测IgG抗体效价;同时处死小鼠,无菌取脾,分离淋巴细胞,采用ELISPOT法检测抗原特异性的IFNγ水平。将豚鼠随机分为3组:NS组、BCG组和Pro+Al+IC组,NS组和Pro+Al+IC组免疫3次,间隔10 d;BCG组仅免疫1次,于前两组第3次免疫时进行免疫。末次免疫30 d后经皮下注射结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)菌液,攻毒41 d后,处死豚鼠,解剖,检测肝、脾、肺的病变程度,并进行评分,同时分离脾脏Mtb,计算每只豚鼠的脾菌分离对数值。结果经Ag85b多肽和EC多肽刺激后,Pro+Al+IC组IFNγ斑点形成细胞(spot forming cell,SFC)数均显著高于其他各组(P0.000 1或0.05),同组间经Ag85b多肽刺激后的SFC均高于经EC多肽刺激后的SFC。Pro+Al+IC组血清Ag85b特异性IgG抗体效价最高,与Pro+Al组比较,差异有统计学意义(P0.05),但与Pro+IC组比较,差异无统计学意义(P0.05);Pro+Al+IC组血清EC特异性IgG抗体效价最高,与Pro+Al和Pro+IC组比较,差异均有统计学意义(P0.05);同组间Ag85b特异性IgG抗体效价高于EC特异性IgG抗体效价。Pro+Al+IC组豚鼠脏器综合病变指数和脾菌分离对数值均显著高于BCG组(P0.000 1),略低于NS组,但差异无统计学意义(P0.05)。结论氢氧化铝佐剂和PolyIC佐剂联合使用可协同增强结核分枝杆菌抗原Ag85b和EC的细胞免疫应答及体液免疫应答;但Ag85b和EC配伍构成的重组亚单位疫苗对豚鼠预防性保护力较弱,不适合用作暴露前预防。     

重组卡介苗-BE1726D的鉴定及其免疫原性评价

目的鉴定重组卡介苗-BE1726D(rBCG-BE1726D)特异性蛋白的表达,并评价其在小鼠体内的免疫原性。方法将冻干的菌株BCG-SSI和rBCG-BE1726D扩大培养后,超滤浓缩收集上清,超声破碎离心后收获菌体,Western blot法进行特异性蛋白检测。用rBCG-BE1726D和BCG-SSI菌株经腹股沟皮下免疫BALB/c小鼠6周后,分离小鼠脾淋巴细胞,ELISPOT及ELISA法检测脾淋巴细胞干扰素γ(interferonγ,IFNγ)的分泌水平;流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD4~+和CD8~+ T细胞的比例。结果菌株rBCG-BE1726D中存在Ag85B、ESAT-6、RV2626c蛋白;菌株BCGSSI中仅存在Ag85B蛋白。经Ag85B刺激后,BCG-SSI组和rBCG-BE1726D组产生的细胞斑点数均明显高于PBST对照组(P0.05);经PPD刺激后,rBCG-BE1726D组产生细胞斑点数量显著高于BCG-SSI组和PBST对照组(P0.000 1);各组间ESAT-6、Rv2626c、Rv1733c、RpfD刺激所产生的细胞斑点数差异无统计学意义(P0.05)。经Ag85B刺激后,BCG-SSI组和rBCG-BE1726D组产生IFNγ的水平显著高于PBST对照组(P0.05);经PPD刺激后,rBCG-BE1726D组的IFNγ分泌水平与BCG-SSI组差异无统计学意义(P0.05);各组间ESAT-6、Rv1733c、Rv2626c、RpfD刺激产生的IFNγ分泌水平差异无统计学意义(P0.05)。rBCG-BE1726D组CD4~+、CD8~+细胞总比例及CD4~+ T/CD8~+ T比值明显低于BCG-SSI组和PBST对照组(P0.05),CD8~+ T细胞比例明显高于BCG-SSI组和PBST对照组(P0.05)。结论 rBCG-BE1726D有较强的免疫原性,可明显提高BALB/c小鼠的免疫应答水平,但与BCG-SSI比较,其免疫原性无明显优势,需对疫苗的保护力进行进一步研究。     

口蹄疫病毒多价DNA疫苗的构建及其免疫原性

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)多价DNA疫苗,并检测其免疫原性。方法以复合多表位表达盒OAAT及AsiaⅠ型FMDV的P1-2A-3C基因为基础,构建FMDV多价DNA疫苗pIRES-OAAT-P1-2A-3C,并用间接免疫荧光(IFA)方法检测目的蛋白在HeLa细胞中的表达。进一步进行小鼠免疫试验,并应用ELISA法检测小鼠血清抗体,ELISPOT检测小鼠脾淋巴单细胞IFN-γ的分泌水平,流式细胞术检测脾T淋巴细胞亚群数量,淋巴细胞转化试验检测特异性淋巴细胞增殖水平。结果所构建的FMDV多价DNA疫苗在HeLa细胞中获得了正确表达。免疫小鼠后,血清特异性抗体水平、脾淋巴单细胞IFN-γ的分泌、脾T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+的数量及特异性淋巴细胞增殖水平均显著提高。结论已成功构建了FMDV多价DNA疫苗,并诱导小鼠产生了特异性的细胞免疫和体液免疫应答。     

Ipr1DNA疫苗诱导BALB/c小鼠免疫应答的探讨

目的构建真核表达质粒pBud-Ipr1-OriM,探讨其诱导BALB/c小鼠的免疫应答,为新型结核病疫苗的研制提供新思路。方法将鼠胞内病原体抗性基因1(Intracellular pathogen resistance,Ipr1)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tubercu-losis,MTB)的复制子OriM插入真核表达质粒pBudCE4.1,构建pBud-Ipr1-OriM表达质粒(Ipr1 DNA疫苗);将BALB/c小鼠随机分为4组:生理盐水对照组、BCG组、pBud-OriM组及pBud-Ipr1-OriM组,pBud-OriM组及pBud-Ipr1-OriM组经肌肉注射免疫相应的重组质粒,BCG组经背部皮内注射BCG,每隔2周注射1次,共3次;末次免疫后2周,处死小鼠,分离血清,采用ELISA法检测小鼠血清中IL-12和IFNγ的水平;取脾组织,采用流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞数量,同时观察肺脾组织的病理学变化。结果经酶切、测序鉴定证实,重组真核表达质粒pBud-Ipr1-OriM(Ipr1 DNA疫苗)构建成功;pBud-Ipr1-OriM组免疫小鼠血清中IL-12水平及小鼠脾组织中CD4+和CD8+T细胞数量均高于其他组,肺脾组织未见病理学改变。结论 Ipr1 DNA疫苗能有效诱导BALB/c小鼠的细胞免疫应答,为新型结核病疫苗的研制奠定了基础。     

HIV疫苗小鼠免疫原性检测方法的初步建立

目的初步建立HIV疫苗小鼠免疫原性检测方法,并对HIV疫苗进行免疫原性评价。方法选择一种HIVDNA疫苗(D)、2种重组痘苗载体HIV疫苗(M和R),分别免疫BALB/c小鼠,6周后分离血清和脾淋巴细胞,采用ELISOPT和胞内因子染色法检测细胞因子分泌情况,MTS法检测淋巴细胞增殖反应,ELISA法检测血清中抗-HIVIgG和IgA抗体水平。结果D、M和R疫苗均可诱导小鼠产生广泛的免疫应答,ELISPOT法可检出脾细胞分泌IFNγ、IL-2、IL-4和IL-6;胞内因子染色可检出IFNγ、IL-2和IL-4的分泌;D和M组脾淋巴细胞增殖试验阳性数高于R组;D、M和R组血清抗-HIVIgG抗体分别有0/5、1/5和5/5小鼠阳转,各组均未检出血清抗-HIVIgA。结论已初步建立了HIV疫苗小鼠免疫原性检测方法。     

增强ESAT6-CFP10融合蛋白诱导小鼠细胞免疫应答佐剂的筛选

目的筛选能增强特异性抗原早期分泌抗原靶6蛋白(Early secretory antigenic target 6,ESAT6)-培养滤出液蛋白-10(Culture filtrate protein 10,CFP-10)融合蛋白(E1C0)诱导小鼠细胞免疫应答的佐剂,建立基于细胞免疫应答的小鼠模型,以评价基于体外干扰素γ释放分析(IFNγrelease assay,IGRA)结核诊断方法中特异性刺激抗原E1C0的活性。方法建立小鼠IFNγ双抗体夹心SABC-ELISA检测系统,并验证系统的线性、灵敏度、重复性和特异性。将BALB/c小鼠随机分为7组:E1C0+单磷酸类脂A(Monophosphoryl lipid A,MPL)+双十八烷基二甲基溴化铵(Dimethyl dioctadecylammonium bromide,DDA)组、E1C0+DDA组、E1C0+MPL组、E1C0+弗氏不完全佐剂(IFA)组、E1C0组、生理盐水组和MPL+DDA联合组,每组6只,经小鼠后肢内侧皮下免疫3次,间隔2周,免疫剂量为:E1C0 100μg/只,MPL 25μg/只,DDA 250μg/只,IFA 100μl/只。末次免疫4周后处死小鼠,无菌取脾,分离脾淋巴细胞,加入E1C0进行培养,MTT法检测特异性淋巴细胞增殖反应,ELISA法检测培养上清中IFNγ水平。采用筛选出的最佳佐剂与抗原组合免疫3批BALB/c小鼠,进行IFNγ诱生测定。结果检测系统的线性范围为:40～2 560 pg/ml(R>0.98);灵敏度为40 pg/ml;变异系数(CV)<15%,检测大鼠、豚鼠和兔血清IFNγ均为阴性;E1C0+MPL+DDA组、E1C0+IFA组和E1C0+DDA组小鼠特异性淋巴细胞增殖刺激指数均明显高于生理盐水组(P<0.01);E1C0+MPL+DDA组小鼠的脾淋巴细胞经E1C0体外刺激后,产生的IFNγ水平明显高于其他组(P<0.001);重复试验结果显示,E1C0+MPL+DDA组3批小鼠免疫后,脾淋巴细胞诱生的IFNγ水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 E1C0与MPL和DDA联合免疫所诱导的小鼠Th1型细胞免疫应答最强,成功建立了用于评价刺激抗原E1C0活性的小鼠模型。     

结核菌H37Ra在小鼠体内诱导的免疫应答

目的检测结核菌H37Ra免疫小鼠后产生的特异性细胞免疫和体液免疫应答水平。方法将BALB/c小鼠随机分为H37Ra组、BCG组和生理盐水(NS)组,分别进行免疫,免疫8周后处死小鼠,分离血清,ELISA间接法测定血清特异性抗PPDIgG抗体的水平,流式细胞分析仪检测脾脏T淋巴细胞亚群的变化。脾淋巴细胞经体外培养、PPD刺激后,MTT法检测脾淋巴细胞的刺激指数,ELISA法检测培养上清液中IFN-γ和IL-4的水平。结果H37Ra免疫小鼠血清中抗PPDIgG抗体、脾脏CD3+T细胞和CD4+T细胞的百分率、脾淋巴细胞刺激指数、IFN-γ和IL-4水平均显著高于NS对照组,但与BCG组差异无显著意义。各组间脾脏CD8+T细胞、CD4+T/CD8+T比值差异均无显著意义。结论H37Ra免疫小鼠后,可以产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答,有望成为结核疫苗的候选抗原。     

乙型肝炎疫苗-卡介苗联合疫苗细胞免疫的研究

目的评价乙型肝炎疫苗-卡介苗联合疫苗对小鼠细胞免疫的影响。方法采用BALB/c小鼠,试验组分为联合疫苗组、卡介苗组、乙肝疫苗组,对照组分为空白组和保护剂组,各组小鼠分别于接种后1个月及2个月,取脾进行淋巴细胞转化试验以及细胞因子和T淋巴细胞表面标记检测。结果联合疫苗组淋巴细胞转化刺激指数、IL-2含量均明显高于卡介苗组和乙肝疫苗组;CD4+/CD8+值高于单价乙肝疫苗组,而与卡介苗组差异无显著意义。结论乙型肝炎疫苗-卡介苗联合疫苗能有效地诱导细胞免疫。     

耻垢分枝杆菌与卡介苗作为载体在鼠结核病治疗中的作用比较

目的比较耻垢分枝杆菌(MS)与卡介苗(BCG)作为载体在鼠结核病治疗中的作用。方法分别以不同剂量的MS和BCG免疫BALB/c小鼠,观察二者的致病作用。以结核分枝杆菌H37Rv感染BALB/c小鼠4周后,分别用生理盐水、MS、GLS/IL-12、重组MS、BCG及GLS/IL-12重组BCG治疗6次,于第6次治疗后7d处死小鼠,检测肺、脾荷菌量、血清IL-12和IFN-γ水平、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的水平及肺、脾组织中颗粒溶素表达,并观察小鼠肺组织病理改变。结果重组MS和重组BCG组器官荷菌量明显低于MS和BCG组;重组MS和重组BCG组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于MS和BCG组,MS和BCG组明显高于生理盐水组;重组MS和重组BCG组脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的水平明显高于其他组;MS与BCG组比较,重组MS与重组BCG比较,荷菌量、病理变化、肺、脾中的IL-12和IFN-γ水平差异均无显著意义;淋巴细胞中的IFN-γ和TNF-α水平,MS与BCG组差异有显著意义,而重组MS与重组BCG组差异无显著意义;重组MS和重组BCG组在肺、脾中均有颗粒溶素表达;MS所致病变比相同剂量BCG轻。结论MS与BCG一样,可将要表达的基因靶向递送到相应的组织,并诱导特异性细胞免疫,同时其在体内的副作用低于BCG,因此可作为良好的有机载体。     

重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白的原核表达、纯化及其生物活性

目的原核表达、纯化重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,并检测其生物活性。方法将Ag85a-ESAT6融合基因片段插入pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物在变性条件下经Ni-琼脂糖凝胶层析柱纯化复性后,在体外对经5种不同类型的表达结核杆菌Ag85a和ESAT6的重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞进行刺激,以MTT法检测脾淋巴细胞的增殖反应。结果重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约41000,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的55.65%;纯化复性的重组融合蛋白纯度达95%以上,表达量约为1.2g/L发酵液,且具有良好的反应原性;与空痘苗病毒或生理盐水免疫的小鼠相比,5种重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞与Ag85a-ESAT6融合蛋白共培养后,增殖活性明显升高(P<0.01)。结论成功利用原核系统表达了结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,纯化复性的Ag85a-ESAT6融合蛋白具有生物学活性。     

含CpG基序寡核苷酸对rHBsAg免疫小鼠脾脏组织及细胞增殖的影响

目的探讨合成含CpG基序的寡核苷酸(CpGODN)与重组乙型肝炎表面抗原(rHBsAg)联合免疫对小鼠脾脏淋巴组织及细胞增殖的影响。方法经后腿胫骨前肌初次免疫BALB/c小鼠,2周后加强免疫1次;常规石蜡切片,H-E染色,观察脾脏组织学改变;3H-TdR掺入法检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果抗原+CpG组脾脏可见明显的组织学改变。加CpG与不加CpG的2组比较,淋巴细胞增殖反应显著增强。结论CpGODN能够有效刺激小鼠脾脏组织T细胞区淋巴细胞增生,生发中心明显增大,而且能够显著增强淋巴细胞增殖反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5、M蛋白基因核酸疫苗表达质粒的构建及其免疫原性

目的构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株GP5、M蛋白基因核酸疫苗表达质粒,并检测其免疫原性。方法用RT-PCR法扩增PRRSV的GP5和M蛋白基因片段,克隆至真核表达载体pIRES-neo中,构建真核表达质粒pIRES-G和pIRES-M,制备核酸疫苗,以其单独或联合免疫小鼠,检测其免疫原性。结果真核表达质粒pIRES-G和pIRES-M经酶切鉴定证明构建正确。第1次免疫后4周,各重组质粒免疫组小鼠血清ELISA抗体水平均显著升高,其中pIRES-G + pIRES-M组抗体水平最高;第1次免疫后9周,pIRES-G + pIRES-M组小鼠血清中和抗体效价(1∶16)高于pIRES-G组(1∶8)和pIRES-M组(1∶4),但均低于灭活疫苗组(1∶64);第1次免疫后9周,与pIRES-neo组相比,各组免疫小鼠脾细胞经特异性(PRRSV)和非特异性(ConA)抗原刺激后,均有明显的增殖,对非特异性刺激反应比特异性刺激反应略强。结论已成功构建PRRSV GP5、M蛋白基因核酸疫苗表达质粒,二者联合免疫效果更好。