大肠杆菌生产琥珀酸的代谢工程研究进展

琥珀酸是一种重要的化工原料,具有广阔的市场. 微生物发酵法生产琥珀酸可以解决常规化学合成法对石油的依赖. 代谢工程的兴起使重组大肠杆菌生产琥珀酸变为可能,也取得了一定的成效,但是其发酵强度还不够高,且过程中伴随着其他有机酸的积累,因此还不适于工业化生产. 代谢工程以系统生物学为基础,为重组大肠杆菌的进一步改造提供了更合理的依据. 本工作以大肠杆菌生产琥珀酸所涉及的关键酶、代谢途径及其改造为对象,系统综述了大肠杆菌生产琥珀酸所涉及的代谢工程技术及其最新研究进展,并探讨了将来的发展前景.     

代谢工程改造大肠杆菌生产琥珀酸

琥珀酸（succinic acid）是一种四碳二羧酸,在食品、医药、塑料和化工行业具有广泛的应用。目前,微生物法生产琥珀酸存在得率低、生产强度低、副产物积累等问题。为此,本研究通过复合诱变（ARTP和⁶⁰Co-γ射线）筛选到一株耐高渗突变株FMME-N-2,其琥珀酸得率为0.70g/g葡萄糖,同时积累18.8g/L乳酸、7.6g/L甲酸和17.3g/L乙酸。为了提高琥珀酸得率,通过敲除乳酸脱氢酶基因（ldhA）、丙酮酸-甲酸裂解酶-甲酸转运蛋白基因（pflB-focA）、磷酸转乙酰基基因（pta）、丙酸激酶基因（tdcD）和a-酮丁酸甲酸酯裂解酶基因（tdcE）,阻断冗余代谢支路减少副产物积累,获得工程菌株FMME-N-13,琥珀酸得率增加到0.92g/g葡萄糖,同时副产物大大降低,积累0.6g/L乳酸、3.6g/L甲酸和12.3g/L乙酸。同时,通过调控RBS强度组合优化来自产琥珀酸放线杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因（AsPCK）和来自博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因（CbFDH）的表达水平,调控胞内ATP和NADH的浓度,最优工程菌FMME-N-26（FMME-N-13-L-AsPCK-L-CbFDH）的琥珀酸得率增加至1.04g/g葡萄糖,仅积累5.5g/L乙酸;最终,对厌氧阶段葡萄糖浓度进行优化,当葡萄糖浓度控制在0~5g/L时,菌株FMME-N-26的琥珀酸浓度增加到111.9g/L,得率为1.11g/g葡萄糖（理论产率的99%）,生产强度为1.76g/L/h,为琥珀酸的工业化生产奠定了良好的基础。     

大肠杆菌生产CoQ10的代谢工程研究进展

随着对CoQ生物合成途径及其调控机制的深入研究,利用代谢工程的方法定向地改良菌种,优化CoQ10的代谢途径,成为提高CoQ10发酵水平的新思路。本文总结了重组大肠杆菌生产CoQ10过程中其代谢途径及其途径修饰的研究进展,分析了生产CoQ10的代谢工程限制因素,提出了利用重组大肠杆菌生产CoQ10的代谢工程策略。     

代谢工程改造酵母生产香料的研究进展

天然产物香料作为食品、药品和日用化学品的添加成分,市场需求高,有着较高的开发利用价值。从动植物中提取香料产物存在来源少、含量低和分离困难等缺点,化学合成香料又存在着安全隐患和污染问题,很难满足市场需求。因此,研究与开发生产天然产物香料的微生物来补充或代替原有的传统提取和化学合成方法具有重要的理论意义和潜在的应用价值。酵母菌作为代谢工程菌株的一类,细胞内具有更好表达异源蛋白的细胞结构和翻译后修饰机制。文章总结了有关对酵母菌进行代谢改造生产萜类、芳香族类及脂肪族类香料化合物的具体实例和研究进展,包括所涉及的宿主菌株、关键酶、代谢途径、改造策略以及发酵条件优化等,并在最后讨论了酵母代谢工程改造生产天然产物香料目前所面临的问题和未来的发展方向。     

代谢工程改造酵母生产多不饱和脂肪酸的研究进展

多不饱和脂肪酸因其在食品和医药领域的广泛作用而得到人们极大的关注,当前利用微生物发酵生产多 不饱和脂肪酸具有诸多优点,由于酵母生产迅速且生物量较高,利用酵母生产多不饱和脂肪酸已成为人们关注 的热点。本文综述了代谢工程改造酵母生产多不饱和脂肪酸的研究进展,以常规酵母-酿酒酵母和非常规酵母- 解脂耶氏酵母为例,介绍了酵母菌中多不饱和脂肪酸的代谢途径、酵母产油脂的生化机制、代谢工程改造酵母 产多不饱和脂肪酸以及不饱和脂肪酸积累对酵母耐受性的影响。以后研究工作的重点是进一步加强对酵母生产 多不饱和脂肪酸的机理研究,并以此为来指导代谢工程改造酵母生产多不饱和脂肪酸。     

代谢工程改造蛋氨酸代谢途径构建高产L-蛋氨酸大肠杆菌

以Escherichia coli BL21(DE3)为出发菌株,敲除其蛋氨酸合成途径中关键酶的阻遏基因metJ,使菌株积累蛋氨酸达22 mg/L. 在此基础上,利用紫外诱变筛选育出一株抗蛋氨酸结构类似物的蛋氨酸高产菌株YB12,使蛋氨酸产量提高到60 mg/L. 通过过量表达蛋氨酸合成途径中的metA和cysE基因及编码蛋氨酸转运蛋白的yeaS基因,YB12菌株积累蛋氨酸量提高到251 mg/L. 结果表明,蛋氨酸在胞外的积累受多个基因、多种代谢途径调控,单独敲除某个基因或改造某个途径不能使蛋氨酸大量合成和积累,对多个代谢途径共同改造是构建蛋氨酸工程菌的最有效方法.     

代谢工程改造微生物固定二氧化碳研究进展

微生物固定CO₂是实现CO₂资源化利用的有效策略之一,为固碳减排、节能生产与绿色合成提供了借鉴。然而,微生物在固定CO₂过程中存在底物利用效率低、能量需求量大、路径难优化等问题。为了解决这些问题,本文总结了6种天然CO₂固定途径与5种人工CO₂固定途径,并从自养微生物、异养微生物和人工微生物三个方面系统分析了代谢工程改造微生物固定CO₂合成化学品的最新进展。在自养微生物固定CO₂方面,采用的策略主要包括提高CO₂固定途径效率、开发能量捕集系统与调节碳代谢流分布;在异养微生物固定CO₂方面,常用的方法主要有强化羧化途径、重构CO₂固定途径与优化能量供给;在人工微生物固定CO₂方面,主要的研究思路是设计人工CO₂固定途径与构建人工CO₂固定微生物。最后,从CO₂固定的关键酶、途径和微生物...     

色氨酸酶重组基因表达及其酶法合成L-色氨酸

为实现色氨酸酶高效、低成本催化合成L-色氨酸,利用p ET30a为载体在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中重组表达了产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)来源的色氨酸酶,以丙酮酸、吲哚和氨为底物,探究其酶学性质,考察了反应温度、起始p H、底物摩尔比对酶促反应的影响,并利用丙酮酸发酵液为底物酶法合成L-色氨酸。结果表明,色氨酸酶重组表达成功,色氨酸酶最佳反应条件为:温度35℃,起始p H=9.0,底物摩尔比n(吲哚)∶n(丙酮酸)=0.6∶1,底物丙酮酸浓度为0.17 mol/L。利用重组色氨酸酶全细胞催化100 m L浓度为0.57 mol/L丙酮酸发酵液,流加浓度为4.27 mol/L吲哚酒精溶液6.5 m L,反应28 h后,L-色氨酸浓度达0.25 mol/L,吲哚摩尔转化率达91.8%。     

L-色氨酸的应用

介绍了L-色氨酸（L-Trp,w）因其特有的吲哚环结构能够作为π电子供体参与形成的cation-π复合体以及作为外源引入和内源性荧光生色团应用于蛋白质、药理研究、环境监测、食品监测等方面的应用。     

重组色氨酸合成酶催化合成L-5-羟基色氨酸

利用重组色氨酸合成酶催化合成L-5-羟基色氨酸,采用单因素以及响应面分析方法考察了p H、反应温度、底物浓度和底物摩尔比对L-5-羟基色氨酸合成的影响。最佳转化条件为:反应温度为32℃,p H=8.6,5-羟基吲哚与工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸的适宜底物摩尔比为1.1∶1,底物工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸最适合浓度为180 mmol/L,反应平衡时间为18 h,工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸摩尔转化率达到86.5%。     

乳酸生产中的微生物代谢工程

从代谢工程的角度综述了同型及异型乳酸发酵的代谢途径、乳酸菌代谢模型、乳酸脱氢酶在乳酸生产方面的应用、米根霉发酵生产乳酸的代谢工程和基因工程阻断乙醇代谢途径改造乳酸的生产过程等方面的研究进展,讨论了生物信息学及环境胁迫对乳酸代谢的影响,展望了乳酸的微生物代谢工程的发展趋势.     

固定化色氨酸合成酶基因工程菌合成L-色氨酸的研究

以海藻酸钠作为包埋剂、戊二醛作为交联剂和氯化钙作为填充剂对色氨酸合成酶基因工程菌进行固定化,同时探究三种物质和菌体负载量对固定化菌影响,响应面法优化色氨酸合成酶基因工程菌合成L-色氨酸。固定化色氨酸合成酶基因工程菌最优制备条件为：海藻酸钠28.92 g/l、戊二醛0.95%、氯化钙19.82 g/l、菌体负载量25 g/l。底物L-丝氨酸浓度为1%、固定化菌8g, L-色氨酸转化率为28.16%。固定化菌可连续使用15批次。     

L-色氨酸中试生产研究

为提高L-色氨酸发酵水平,在100L发酵罐上考察了不同操作条件对大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的影响。结果表明不同操作条件对L-色氨酸发酵有显著影响。残糖浓度、补料方式、柠檬酸钠添加质量分数、接种量及溶氧量分别控制在5 g/L、溶氧控制脉冲补料、2 g/L、5%及10%～15%时,发酵效果最好,在1 m3罐上进行验证实验,L-色氨酸产量稳定在40 g/L左右。     

微生物法生产1,3-丙二醇过程的代谢工程研究进展

代谢工程在微生物发酵法生产化工产品的过程中扮演着越来越重要的角色. 本研究以生物法生产1,3-丙二醇所涉及的关键酶、代谢途径及其改造为考察对象,系统综述了微生物法生产1,3-丙二醇所涉及的代谢工程技术、最新应用情况及其进展,并展望了未来的发展趋势.     

大肠杆菌乙酰辅酶A代谢调控及其应用研究进展

利用生物法合成生物基化学品具有高效、绿色、可持续发展等优势。乙酰辅酶A作为细胞内物质代谢的重要中间产物,是利用生物转化法合成许多生物基化学品的重要前体,在微生物碳代谢过程中发挥着枢纽作用。本文综述了大肠杆菌乙酰辅酶A的合成、代谢调控策略及其重要应用,重点总结了乙酰辅酶A的合成途径及近期发展的提高乙酰辅酶A胞内通量的代谢调控策略,包括乙酸途径的代谢调控、丙酮酸合成乙酰辅酶A途径的代谢调控、中心碳代谢途径的代谢调控、β氧化合成乙酰辅酶A途径的代谢调控和乙酰辅酶A合成新途径的发掘,进一步展望了提高乙酰辅酶A供给的策略,利用基因组编辑技术构建合成乙酰辅酶A为前体化学品细胞工厂的方法。     

包埋法固定化色氨酸合成酶基因工程菌合成L-色氨酸的研究

以海藻酸钠作为包埋剂、戊二醛作为交联剂和氯化钙作为填充剂对色氨酸合成酶基因工程菌进行固定化,同时探究3种物质和菌体负载量对固定化菌影响,响应面法优化色氨酸合成酶基因工程菌合成L-色氨酸。固定化色氨酸合成酶基因工程菌最优制备条件为:海藻酸钠28.92 g/L、戊二醛0.95 g/L、氯化钙19.82 g/L、菌体负载量25 g/L,底物L-丝氨酸质量浓度为10 g/L、固定化菌8 g,L-色氨酸产率为28.16%,固定化菌可连续使用15批次。     

大肠杆菌色氨酸操纵子基因突变株的构建与表达

目的构建大肠杆菌色氨酸操纵子基因突变株,提高邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的产量。方法利用依赖于DpnⅠ酶的PCR方法突变表达载体pET-22b(+)-Trp Operon上的关键位点,PCR扩增Trp OperonM基因,构建pET-22b(+)-Trp OperonM重组表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。制备粗酶液,经比色法测定邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性。结果 PCR扩增产物可见约7000bp的Trp OperonM条带;所构建的重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确;邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性比大肠杆菌BL21(DE3)空菌分别提高了4.5倍和5.2倍。结论已成功构建了大肠杆菌色氨酸操纵子基因突变株BL21(DE3)/pET-22b(+)-Trp OperonM,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性均有提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定了基础。     

离子交换树脂吸附L-色氨酸的动力学研究

通过静态吸附实验,研究了L-色氨酸在001×7型阳离子交换树脂上的等温吸附和吸附动力学特性.采用动边界模型描述L-色氨酸在该树脂上的交换行为,考察了料液浓度、树脂粒径和温度对交换过程的影响.结果表明,L-色氨酸在001×7型阳离子交换树脂上的吸附等温线符合Langmuir等温方程,且随pH降低,树脂的最大平衡吸附量逐渐增大;交换过程的吸附速率随L-色氨酸浓度和温度的升高而增大,但随树脂粒径的增大而减小;离子交换过程的速度控制步骤为颗粒扩散控制.交换过程的反应速率常数k0为1.199×10-5,反应级数a为1.7,表观活化能Ea为19.94kJ·mol-1,并得到了动力学总方程式.     

木糖发酵酒精代谢工程的研究进展

木糖发酵是生物转化木质纤维素产生酒精及其他化工产品最为重要的一环,但自然界中缺少能将上述生物质有效转化为乙醇的微生物菌种. 近年来,根据代谢工程原理,利用基因工程技术对酵母和细菌进行遗传改造,或将木糖代谢途径引入传统的酒精发酵菌酿酒酵母及高酒精产生菌运动发酵单胞菌中,从而拓展其底物利用范围;或使原本可以利用多种糖底物的细菌获得选择性产生酒精的能力,构建了各种不同类型的木糖发酵重组菌株. 虽然这些重组菌株在木糖转化酒精方面均显示出良好的应用前景,但仍存在诸多问题. 有必要在对木糖代谢调控机制深入系统研究的基础上,进一步改造现有菌株,并结合生化工程技术对重组菌株发酵条件进行优化,以实现高效生物转化木质纤维素原料制取乙醇. 本工作介绍了近年来代谢工程改造微生物菌种发酵木糖生产酒精的研究进展.