猪白血病抑制因子(LIF)的原核表达

根据GenBank中猪LIFcDNA基因序列扩增出目的基因片断,并将扩增的片断克隆进pET-31b表达载体的Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点之间,经转化使其在大肠杆菌BL21中表达,产生重组猪LIF蛋白.结果表明,所构建的原核表达质粒PET-31b-mpLIF含有编码成熟型猪LIF蛋白的cDNA序列;表达结果显示,诱导样品在相对分子质量约20000的位置上有明显的增强表达条带.     

杂合抗菌肽MT在大肠杆菌中的融合表达

为了在大肠杆菌中表达杂合抗菌肽Magainin-Thanatin(MT).通过大肠杆菌密码子偏爱性优化两抗菌肽基因序列,SOE-PCR技术构建克隆载体并测序;将其转化至表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)中构建基因工程菌,表达产物做抑菌活性分析.结果在本研究中经SOE-PCR拼接后得到了杂合肽片段,成功构建了表达载体pGEX-6P-1-MT;转化后得到了重组菌株pGEX-6P-1-MT/BL21(DE3);获得诱导产物分子质量约3.35kDa;其对大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌等均有抑制作用.这表明杂合肽MT可以在大肠杆菌BL21(DE3)中融合分泌表达且具有抗菌活性.     

人参皂苷葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及包涵体的变复性

将人参皂苷葡萄糖苷酶的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。对该基因进行诱导表达,并对包涵体进行变性和复性。结果显示,经终浓度为0.5mmol/L IPTG在30℃下诱导表达4h,进行SDS-PAGE分析,目的蛋白主要以包涵体形式存在并确定其分子质量约为75ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。包涵体经过变性和稀释复性后,经TLC活性检测,能够水解底物Rb1,表明具有人参皂苷葡萄糖苷酶的活性。     

家蚕小热休克蛋白22.6基因的生物信息学分析及其原核表达

小热休克蛋白家族成员在结构上变化很大,是细胞或生物体被多种类型的胁迫所诱导新合成的或含量增加的一类蛋白质,目前研究相对较少。从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条序列,经过Blast比对和保守结构域分析后发现该蛋白属于家蚕小热休克蛋白,将其命名为BmHSP22.6;通过PCR扩增该基因的ORF序列,将其克隆到pET28a(+)表达载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,获得重组质粒pET-28a-BmHSP22.6。该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得工程菌,用终浓度为1 mM的IPTG诱导目的基因表达。用镍柱分离上清裂解液,获得纯化的目的蛋白。     

HCV e2-3pcx融合基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

构建了丙型肝炎病毒e2-3pcx融合基因的原核表达载体pET28b(+)-e2-3pcx,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。IPTG诱导融合蛋白高效表达。经SDS-PAGE电泳分析,结果表明在43 ku处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致。     

哈茨木霉几丁质酶基因的cDNA克隆及表达

为了研究全新几丁质酶基因Chit37(DQ647957)的特性与功能,将该基因在大肠杆菌中进行了外源表达.通过构建哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了基因Chit37的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为1032bp,编码343个氨基酸,理论分子量为36.6kDa.采用PCR扩增的方法克隆该基因并将其构建到原核表达载体pET28(a+)上,构建了原核表达载体pET-Chit37并转化宿主菌BL21(DE3),菌落PCR及酶切鉴定均证实转化子的正确性,重组蛋白经IPTG诱导后获得表达.优化的表达条件为终浓度0.1mM IPTG诱导培养4h.     

HIV-1蛋白酶在大肠杆菌中的表达

分泌融合表达HIV-1蛋白酶(Protease,PR),用于对HIV蛋白酶抑制剂的筛选.利用重叠延伸PCR方法,获得使用大肠杆菌偏爱密码子的编码HIV-1蛋白酶(PR)的基因,将目的基因重组至原核表达载体pET-SP-DsbA-T,得到"pET-SP-DsbA-PRsite-PR"分泌融合表达型载体,重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3).工程菌在LB培养基中添加终浓度为0.1 mM的IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析周质蛋白.DNA测序结果证实合成的HIV-1 PR基因与设计的序列完全一致,在周质空间表达出具有自切割活性的HIV-1 PR蛋白.研究成功合成并克隆了使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1 PR的DNA编码序列,经表达鉴定得到具有自切割活性的HIV-1 PR蛋白.     

建兰花色调控关键基因的克隆与表达

对建兰花色形成的关键调控基因(CHS)编码区片段克隆至pET28a质粒,转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3).SDS-PAGE检测表达产物,针对IPTG浓度、温度与时间等因素,优化其最佳诱导表达条件.结果显示:(1)总RN A提取质量高,经反转录成cDNA,设计引物通过PCR扩增,琼脂糖电泳显示片段为1200 bp;(2)对转化子进行菌落PCR与质粒双酶切鉴定,片段大小均为1200 bp与预计相符,经测序获得片段插入方向正确,未发生突变,可用于蛋白诱导表达;(3)诱导表达优化显示,温度为37℃、IPTG浓度1 mM及诱导时间6 h是重组子(pET28-CeCHS1)在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达的最佳条件.     

大肠杆菌中可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子21及制备

为在大肠杆菌中高效、非融合、可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子21(rhFGF-21),研究了纯化方法,以获得具有较高生物活性的rhFGF-21。全基因合成人成纤维细胞生长因子21cDNA序列,克隆进原核表达载体pET-3c,在转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS中进行表达。表达产物经盐析、层析等方法纯化后,利用3T3-L1细胞鉴定其促葡萄糖摄取的生物学活性。结果表明:rhFGF-21在BL21(DE3)PlysS实现了高效、非融合、可溶性表达,目的蛋白占菌体总蛋白的20%左右;表达产物经纯化后,纯度可达95%以上;表达产物能够明显促进3T3-L1细胞对葡萄糖的吸收。该方法成功实现了rhFGF-21在大肠杆菌中高效可溶性表达。     

人血清淀粉样蛋白A1原核表达及胶体金检测方法的建立

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的SAA1定量检测新方法.利用大肠杆菌BL21(DE3)原核表达人血清淀粉样蛋白A1(SAA1),根据BL21(DE3)表达偏好性设计并合成SAA1蛋白基因片段,构建表达载体pET-28a-SAA1,采用CaCl2法制备BL21(DE3)感受态,热激转化法将pET-28a-SAA1转入到BL21(DE3).经表达条件优化,获得重组蛋白最佳诱导表达条件:温度30℃,时间6h,转速180rpm/min,培养基pH 7.0,IPTG浓度0.4mM,诱导表达后目的蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定,Ni柱纯化、透析、浓缩从而获得浓度为8.09mg/ml,纯度为85%的SAA1.同时,结合胶体金标记技术,建立了SAA1胶体金免疫层析试纸检测方法,线性范围0.16~500μg/ml,最低检测限0.16μg/ml,该研究为临床体外诊断SAA1快速检测提供技术基础.