RNA干扰技术抑制乳腺癌细胞系MDA-MB-231中SATB1的表达

构建含有靶向satb1基因的siRNA质粒,体外观察对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的SATB1mRNA以及蛋白质表达的影响。设计合成三对靶向人源satb1基因的siRNA,并分别克隆在质粒载体上,在脂质体的介导下转染高表达SATB1的乳腺癌细胞系MDA-MB-231。运用RealTime-PCR方法分析SATB1mRNA的表达情况,Western-Blot方法检测蛋白的表达量。结果表明:经过酶切鉴定和测序证实三个重组质粒psiS823、psiS2567、psiS3373分别构建成功,转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231能明显抑制SATB1mRNA及蛋白的表达。说明本试验成功构建的重组质粒psiS823、psiS2567、psiS3373都能有效降低的人乳腺癌细胞MDA-MB-231中SATB1的表达,为SATB1高表达的乳腺癌基因治疗提供了新方法。     

siRNA特异抑制树突状细胞BAK基因表达的研究

本文探讨了小干扰RNA(siRNA)对人树突状细胞(DC)中促凋亡基因BAK表达的影响。针对BAK基因区设计了2条高效特异的siRNA,合成相应的oligoDNA;构建重组质粒psi-BAK-1与psi-BAK-2,并对这些质粒进行了限制性酶切、测序等鉴定工作;在脂质体的介导下转染树突状细胞,转染后72h收集细胞,用蛋白印迹法检测Bak蛋白的表达量;并通过流式细胞仪检测转染后72h树突状细胞的存活率。结果表明,经过酶切鉴定和测序证实两个重组质粒psi-BAK-1、psi-BAK-2分别构建成功;WesternBlot结果显示转染后72h,si-BAK-1对Bak蛋白表达的抑制率为(51.5±3.54)%,si-BAK-2对Bak蛋白表达的抑制率为(26.5±6.36)%;转染重组质粒后72h树突状细胞存活率分别为93.95%、89.66%,均高过对照组的88.00%。si-BAK-1、si-BAK-2都能有效降低树突状细胞中BAK基因的表达,为延长树突状细胞的寿命,增强抗原递呈能力提供了新的思路和方法。     

猪β_2肾上腺素受体的表达、纯化及鉴定

研究了β2肾上腺素受体(β2 adrenergic receptor,β2AR)基因重组表达质粒在人胚肾细胞293(Human embryonic kidney cells293,HEK293)中的瞬时转染及表达产物的纯化和鉴定。将已构建的重组表达质粒瞬时转染HEK293细胞,表达产物制备粗膜蛋白后,采用镍离子亲和层析法纯化得到受体蛋白并进行鉴定。结果表明:重组表达质粒p Tri Ex-1.1 Hygro-β2AR1-418转染HEK293细胞后表达量和蛋白活性较优,最佳表达时间为转染后72 h。SDS-PAGE和Western blot结果显示,在47 ku左右出现了特异性条带,咪唑的最佳洗脱浓度为250 mmol/L,受体蛋白纯度大于80%。活性鉴定表明:受体蛋白与HRP酶标记的3种β激动剂均能特异性结合,检测HRP-克伦特罗、HRP-莱克多巴胺和HRP-沙丁胺醇的OD值分别为0.97、0.91和0.94。通过纯化得到的受体蛋白,约占粗膜蛋白的4.4%。本试验成功获得一定数量纯度和活性较好的β2AR受体蛋白,为受体技术在β激动剂多残留检测中的研发和应用奠定了基础。     

肝脏特异性基因疫苗研究

本研究构建了肝脏特异性表达的载体,为进一步构建肝脏特异性的siRNA载体做前期准备。通过PCR方法扩增得到人Alpha-1抗胰蛋白酶(human-α1-anti-Trypsin)启动子片段(以下简称hAAT启动子)。回收纯化后克隆到pCDNA6载体中,同时以EGFP作为标记蛋白。将构建好的载体分别转染到肝癌细胞HePG2、乳腺癌细胞MDA-MB-231和肺癌细胞A549中,验证其在肝脏中特异性表达的能力。然后在荧光显微镜下观察。结果表明:载体在肝癌细胞中能很好的表达EGFP,在肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MDA-MB-231中不表达EGFP。说明采用human-α1-anti-Trypsin启动子可以实现目的基因在肝癌细胞中特异性表达,这项研究应用于抗肝癌、肝炎的siRNA基因治疗,将有利于显著提高治疗效果,减少对身体的副作用。     

腰果主要过敏原Ana o 2原核表达及免疫学鉴定

目的 构建Ana o 2重组表达质粒,原核表达重组蛋白并评价其免疫活性。方法 将Ana o 2基因构建到pET-28a(+)载体中,测序正确的重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,诱导表达目的蛋白并进行质谱鉴定。利用腰果过敏阳性血清,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和蛋白质免疫印记(Western blot)法评价重组Ana o 2的免疫活性。结果 重组蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表明分子量为54 kD,与理论值相符,经质谱鉴定为Ana o 2。ELISA结果显示,用重组Ana o 2检测腰果过敏阳性血清与阴性血清特异性IgE抗体(sIgE)水平差异有统计学意义(t=2.44,P<0.05)。Western blot结果表明,重组Ana o 2与腰果过敏患者血清反应性良好。结论 利用原核系统表达了Ana o 2,并且重组Ana o 2与腰果过敏患者血清具有良好的反应性。     

β_2肾上腺素受体基因在Sf9细胞中的表达及纯化

通过密码子优化、昆虫杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)构建、表达条件筛选及镍柱亲和层析,研究β_2肾上腺素受体(β_2 adrenergic receptor,β_2AR)基因(β_2AR)在昆虫细胞Sf9中的高效表达及纯化策略。方法:人工合成改造后的β_2AR基因,将其克隆至转移载体p Fast Bac1中,构建重组杆状病毒表达质粒p Fast Bac1-β_2AR’,转染昆虫细胞Sf9,优化表达条件,采用镍离子亲和层析法纯化重组蛋白并进行活性鉴定。结果:适宜的表达条件为感染细胞使用的感染复数5、感染后表达时间48 h,Western blot分析显示在47 k D左右处出现清晰的特异性条带,与预期结果一致。纯化的受体蛋白纯度大于90%,活性鉴定结果显示该受体蛋白可特异性吸附盐酸克伦特罗、沙丁胺醇及莱克多巴胺3种β激动剂的酶标记物,OD值分别为0.983、0.947和0.912。结论:本研究实现了β_2AR受体在Sf9细胞中的表达,且纯化后的受体蛋白保持了较好的β激动剂亲和活性,为利用β_2AR受体开展β激动剂多残留快速检测技术提供了依据。     

重组人凝血酶真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的稳定表达

目的 构建含重组人凝血酶基因的重组真核表达载体,并转染哺乳动物细胞CHO,建立稳定表达重组人凝血酶的细胞株.方法 利用限制性内切酶EcoR I和XbaI将凝血酶基因插入真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,构建含人凝血酶基因的重组质粒pcDNA3.1 （＋）/thrombin,利用双酶切和测序法鉴定.采用阳离子脂质体介导方法,将构建的表达载体转染到CHO细胞中,通过G418加压筛选出阳性细胞克隆,建立稳定表达人凝血酶的细胞株,并扩大培养.采用RT-PCR和SDS-PAGE法检测其mRNA和蛋白质的表达,并对其生物活性进行鉴定.结果 重组质粒pcDNA3.1 （＋）/thrombin经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误;经RT-PCR和SDS-PAGE法鉴定,转染的CHO细胞可表达、分泌人凝血酶,得到的重组人凝血酶表观相对分子质量（Mr）为43000左右,与预测一致,且具有降解并凝固牛纤维蛋白原的活性,其比活为234.1 U/mg.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 （＋）/thrombin,并成功地在CHO细胞中表达了具有生物活性的重组人凝血酶,该体系的建立为进一步规模化生产重组人凝血酶奠定了基础.     

染料木黄酮抑制AKR1C3抗去势抵抗前列腺癌的生长及其机制研究

目的:研究植物雌激素染料木黄酮（GEN）抑制AKR1C3的表达,进而抑制去势抵抗前列腺癌（CRPC）的生长,为染料木黄酮临床治疗CRPC提供理论依据。方法:在无激素的血清环境下培养22RV1、VCaP、RWPE-1细胞,以不同浓度（0、12.5、25、50、100 μmol/L）的GEN处理48 h。利用CCK-8检测细胞增殖活性。通过AKR1C3 siRNA、AKR1C3抑制剂（ASP-9521）分别与GEN联合干扰22RV1、VCaP细胞,用Western blot检测细胞中PSA及AKR1C3蛋白的表达水平。结果:染料木黄酮能抑制去势抵抗前列腺癌的生长。Western blot结果显示,GEN能够抑制PSA、AKR1C3蛋白的表达,且与AKR1C3 siRNA、AKR1C3抑制剂（ASP-9521）联合作用时,对AKR1C3的抑制效果更为显著。结论:染料木黄酮可能通过抑制去势抵抗前列腺癌细胞中AKR1C3的表达,进而抑制CRPC细胞的增殖。     

Rspo1-EGFP重组腺相关病毒载体的构建

本文通过构建携带Rspo1-EGFP融合基因的重组腺相关病毒载体,包装出含有目标基因的重组腺相关病毒.首先利用PCR从cDNA文库中把Rspo1基因扩增出来,插入到pcDNA6-EGFP中EGFP的上游形成融合基因Rspo1-EGFP.采用AAV Helper-free包装系统,将融合基因用PCR方法从质粒pcDNA6-Rspo1-EGFP上扩增出来,亚克隆到AAV表达质粒pAAV-MCS多克隆位点中,构建出重组质粒pAAV-Rspo1-EGFP.重组质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper磷酸钙法共转染AAV-293细胞制备重组病毒rAAV-Rspo1-EGFP.重组病毒感染AAV-HT1080细胞,荧光显微镜检测病毒介导的目标基因表达,流式细胞技术测定病毒滴度.结果:酶切鉴定和测序确定重组病毒载体pAAV-Rspo1-EGFP构建成功.病毒感染的细胞中检测到绿色荧光,表明重组病毒包装成功并介导融合基因在宿主细胞里表达,病毒滴度达107VP/mL.本研究成功包装出具有侵染性的重组朦相关病毒agV-Rspo1-EGFP,为今后利用腺相关病毒载体进行Rspo1相关的体内体外研究提供了实验基础.     

鉴定活性维生素D细胞模型的构建

本文构建了维生素D受体(Vitamin D receptor,VDR)融合蛋白的真核表达载体,并获得稳定表达VDR融合蛋白的细胞体系,为含有活性维生素D食品及药物的鉴定建立成熟的细胞模型。设计并合成特异性引物扩增VDR基因,将扩增产物克隆至pcDNA3.1/His真核表达载体上,将其转染HEK293细胞。采用免疫沉淀(IP)技术鉴定VDR融合蛋白的表达效率。在构建pcDNA 3.1/VDR-His成功的基础上,用活性1,25(OH)_2D_3处理转染的细胞,收集总蛋白和m RNA,分别利用免疫印迹(Western blot,WB)和实时定量PCR(q RT-PCR)技术,检测VDR融合蛋白以及其下游基因CYP24A1基因的表达。IP结果证实VDR融合蛋白具有转录活性。WB和q RT-PCR结果显示,1 nmol/L浓度的活性1,25(OH)_2D_3处理转染细胞能有效激活VDR蛋白的表达,以及显著增强CYP24A1的m RNA表达(p0.01)。利用该细胞模型检测维生素D类药物的活性,结果显示不同药物中维生素D的活性与药物种类有关。pcDNA3.1/VDR-His融合表达载体构建成功,并以此构建了鉴定活性维生素D的细胞模型。