鮰鱼肌肉组织中不动杆菌的分离及鉴定

将鮰鱼在4℃冷库中取得背部肌肉组织,进行真空包装,在4℃冰箱中贮藏7 d,分离得到2株细菌,分别编号为by 7-2、bs 7-3,进行细菌形态学观察、革兰氏染色、生化鉴定、16S rDNA测序及负染等。结果表明:菌株by 7-2在LB琼脂培养基上为圆形、湿润、白色菌落,菌株bs 7-3在LB琼脂培养基上为圆形、湿润、乳白色菌落;革兰氏染色镜检表明,2株细菌均为革兰氏阴性菌;负染结果表明,by 7-2为短杆菌,bs 7-3为长杆菌,且二者均无鞭毛;生化鉴定结果显示,菌株by 7-2和bs 7-3硝酸盐还原、精氨酸双水解酶、乙酰胺酶、分解木糖、分解麦芽糖、分解甘露醇、DNA酶和氧化酶实验均为阴性,菌株bs 7-3的利用柠檬酸盐和O-F实验为阳性,菌株by 7-2利用柠檬酸盐和O-F实验为阴性;进一步通过16S rDNA测序及系统发育树分析显示,by 7-2与约翰逊不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)亲缘关系最近,相似度达99.90%,bs 7-3与抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens)亲缘关系最近,相似度达99.79%。因此,菌株by 7-2为约翰逊不动杆菌,bs 7-3为抗辐射不动杆菌。     

红曲黄酒来源芽孢杆菌普鲁兰酶基因克隆和生物信息学分析

红曲黄酒酿造原料为大米,淀粉质量分数在70%以上,微生物来源淀粉酶系对淀粉的水解至关重要,影响甚至决定红曲黄酒酿造的原料转化过程和产品品质。从酒曲中分离具有淀粉水解能力的芽孢杆菌2?株,编号BHQ03和BHQ06,进行分子生物学鉴定并分别从2?株菌中克隆获得pulL1和pulL2,pulL3和pulL4共4?个I型普鲁兰酶基因,其中基因pulL1和pulL3均编码713?个氨基酸,序列相似度96.31%,基因pulL2和pulL4均编码852?个氨基酸,序列相似度99.77%。对基因pulL1和pulL2编码蛋白PulL1和PulL2进一步分析发现,二者均属于G13家族,具有4?段特征性保守区域。PulL2的N-端含有32 个氨基酸残基的信号肽序列,且催化活性位点存在突变（D407G）。结合文献研究和三维结构模拟,分析普鲁兰酶的具体催化过程。上述研究为科学解析红曲黄酒酿造的淀粉水解过程提供参考。     

枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的生物信息学分析

该研究应用生物信息学方法对枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA进行分析,旨在为LipA的后续研究奠定一定的理论基础。采用一系列在线网站或软件对LipA的一级结构、亲疏水性、基本特性、二级结构、特殊卷曲螺旋、模体以及富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、丝氨酸（S）和苏氨酸（T）的PEST序列等进行预测和分析,并对三级结构进行同源建模,对其表面电位、可及性分布以及Ramachandran图等进行分析。枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA是一种由212个氨基酸组成的稳定的脂溶性蛋白质,其亲、疏水性最强的区域分别为Lys75~Asn81和Val9~Leu17;不存在稳定的二聚体、三聚体卷曲螺旋和非PEST序列;有3种可能参与不同的生化反应的模体;有5段α-螺旋、6段β-折叠的α/β类蛋白;整体呈弱正电势;LipA的可及性和Ramachandran图表明建模得到的三维结构是合理、可靠的。该研究为后续对枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的分子设计和改造提供了一定的理论基础。     

副干酪乳杆菌乳酸脱氢酶的生物信息学分析

目的：分析和预测副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)基因及其编码蛋白的结构和特性,以指导其生物学功能的实验研究。方法：利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY)中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其他生物信息学分析软件,如ClustalX、VMD,从数据库中得到乳酸脱氢酶基因,分析、预测该基因编码的蛋白理化性质、翻译后的修饰位点、拓扑结构、二级结构、三级结构和功能域。并与其他微生物的乳酸脱氢酶蛋白序列进行比对,得出它们的保守序列。结果：该基因编码335个氨基酸,其蛋白理论分子质量为36608.8u,预测该蛋白有3个跨膜区。与干酪乳杆菌的乳酸脱氢酶进化关系最近。结论：应用生物信息方法可预测得到副干酪乳杆菌的乳酸脱氢酶的结构与功能方面的信息。     

玉米赤霉烯酮降解菌的筛选、鉴定及降解酶初步提取

该实验采用富集培养的方法从土壤中筛选出有效降解玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）的菌株。初筛采用ZEN涂布至无机盐培养基作为唯一碳源,复筛是以菌株的发酵液对ZEN的降解率作为评价指标,得到一株菌株A.lwoffi.Haut.1,其发酵液在37 ℃下与5 μg/mL ZEN共培养48 h,降解率高达93.54%。经16S rDNA基因测序分析、生理生化实验和菌落形态观察初步对菌株进行鉴定,并对该菌株的降解活性物质进行初步定位,最终探究丹宁-聚乙二醇法和盐沉法对无细胞上清液进行粗降解酶的提取效果。结果表明,该菌株鉴定判断为鲁氏不动杆菌（Acinetobacter lwoffii）;该菌株的无细胞上清液的降解率最高为82.31%,无细胞上清液经加热处理、蛋白酶K处理和蛋白酶K+SDS处理后,降解率分别为20.10%、41.67%和18.68%,说明降解活性物质主要为胞外酶;当单宁浓度为15 mg/mL,聚乙二醇溶液浓度为10 mg/mL,提出的酶液降解率为64.33%,而盐沉法加入60%硫酸铵提出的粗酶液降解率为20.30%,因此,单宁聚乙二醇法提取降解酶效果更好。该研究为菌株降解ZEN的作用机理提供了研究基础,也为生物降解ZEN提供了新的研究材料。     

嗜酸乳杆菌zrx02的plnD基因克隆及生物信息学分析

目的:对zrx02嗜酸乳杆菌细菌素编码基因进行克隆与序列分析。方法:对分离出的菌株进行16S rRNA鉴定,并根据已报道的plnD编码产物基因设计引物,以该菌基因组DNA为模板进行PCR扩增和测序,利用Pro Param tool,TMHMM等在线软件对编码蛋白进行生物信息学分析。结果:该菌为嗜酸乳杆菌,命名为嗜酸乳杆菌zrx02,该菌含有plnD基因,通过与Gen Bank中相关的抗菌素基因进行比对,发现其基因序列与Gen Bank库中的Lactobacillus plantarum strain（WP 016526896.1）plnD gene的同源性达到100%。生物信息学分析显示该基因全长355 bp,编码92个氨基酸,相对分子量10.54 ku,理论等电点9.26,该基因编码蛋白是稳定蛋白,不具有明显的跨膜结构,二级结构主要有α-螺旋、无规则卷曲和延伸链组成,三级结构结果显示plnD蛋白模型与Streptococcus pneumoniae中的ComE同源性最高。结论:对嗜酸乳杆菌zrx02 plnD基因的克隆与分析,为进一步探究细菌素的形成机制奠定理论基础。      

不动杆菌来源L-天冬氨酸-β-脱羧酶的表达与酶学性质分析

L-天冬氨酸-β-脱羧酶(L-aspartate-β-decarboxylase,Asd)催化L-天冬氨酸脱羧生成L-丙氨酸,该研究对Acinetobacter radioresistens来源的Asd酶进行酶学性质解析,为工业生产L-丙氨酸提供参考。构建表达质粒pET28a-ArAsd,转化大肠杆菌E. coliBL21(DE3)实现ArAsd基因的异源表达。利用亲和层析纯化获得携带His标签的纯酶后进行酶学性质研究,并考察重组菌底物、产物耐受的能力。结果表明,重组酶比酶活力为753 U/mg,其最适催化温度为55℃,最适反应pH为4. 5,在40～45℃、pH 6. 0～7. 0条件下较稳定,45℃处理3 h酶活力剩余70%左右,pH 7. 0处理12 h酶活力剩余90%左右。产物L-丙氨酸浓度超过500 mmol/L时重组菌细胞酶活力有明显降低,底物L-天冬氨酸对重组菌细胞催化活性有促进作用。该研究首次在E. coli中异源表达Acinetobacter radioresistens来源Asd酶,其比酶活力高于目前已有报道的Asd酶,具有一定的工业应用潜力。     

酸土脂环酸芽孢杆菌Fe-SOD基因克隆及生物信息学分析

酸土脂环酸芽孢杆菌具有嗜酸耐热的独特生理特性,从该属细菌中分离到的多种酶类都具有耐酸热稳定性,是筛选耐酸耐热酶的重要菌种资源。超氧化物歧化酶(SOD)由于具有重要的生理功能而广泛用于食品、药品及化妆品等行业。为了深入探讨酸土脂环酸芽孢杆菌SOD的分子生物学特性,本研究利用同源克隆、交错式热不对称PCR技术和生物信息学方法进行Fe-SOD基因克隆、测序及序列分析。结果表明,Fe-SOD基因(GenBank序列号:JN614998)ORF全长为606bp,编码202个氨基酸,其推测氨基酸序列与来源于酸热脂环酸芽孢杆菌DSM446的Fe-SOD(ACV58017.1)序列相似性最高,为78%。整个蛋白序列含有Fe/MnSODs家族的5个模体,SOD活性中心含有金属离子结合配基His27、His82、Asp164和His168,具有Fe/MnSODs家族典型的蛋白结构特征。酸土脂环酸芽孢杆菌Fe-SOD基因的克隆和生物信息学分析为进一步构建原核表达载体、获得生产耐酸热Fe-SOD的基因工程菌株奠定基础。     

酸土脂环酸芽孢杆菌DnaK基因克隆及生物信息学分析

利用同源克隆和基因组步移技术克隆得到酸土脂环酸芽孢杆菌(DSM 3922T)DnaK基因全序列,其ORF全长1 854 bp,编码617个氨基酸,推测其氨基酸序列与来源于A.acidocaldarius LAA1的分子伴侣蛋白DnaK同源性最高,相似性达86%。利用同源建模对DnaK的二级结构和超二级结构的预测结果显示,该伴侣蛋白主要由α-螺旋和β-折叠组成,基本不含无规则卷曲,具有耐热蛋白质的特征。     

植物乳杆菌LY-78乳酸脱氢酶基因的生物信息学分析

目的:探究植物乳杆菌LY-78菌株全部5个乳酸脱氢酶基因及其编码蛋白质的结构和功能。方法:应用多种生物信息学软件对植物乳杆菌LY-78菌株的5个乳酸脱氢酶基因及氨基酸序列进行结构分析和功能预测。结果:植物乳杆菌LY-78中5个乳酸脱氢酶的核苷酸及氨基酸序列均具有较高的保守性,均为位于细胞质的热稳定性、非分泌、非跨膜蛋白,除了ldh L3基因,其余4个基因均具有各自高度保守的功能位点和结构域,均存在典型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD~+)结合位点序列GXGXXG。结论:乳酸脱氢酶D1(D1-lactate dehydrogenase,D1-LDH)、D2-LDH、L1-LDH及L2-LDH均具有完整的功能位点和结构域,很可能具有真正的乳酸脱氢酶活性,L3-LDH由于缺失NAD~+结合结构域和功能位点,因而可能不具有乳酸脱氢酶活性,这些分析结果为今后植物乳杆菌乳酸脱氢酶基因改造和苯乳酸合成代谢机制研究提供了必要的理论基础。     

乙酰木聚糖酯酶协同木聚糖酶降解木聚糖的研究

探讨了宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)乙酰木聚糖酯酶和第10、11家族木聚糖酶之间的协同作用。利用作者所在实验室构建保藏的3株工程酵母Pichia pastoris GS115/Auaxe、GS115/Auxyn11A和GS115/Auxyn10A进行甲醇诱导发酵,分别获得重组乙酰木聚糖酯酶和木聚糖酶。在木聚糖酶最适p H、40℃、料液质量体积比1 g∶60 m L、水解2 h的条件下分别研究了不同加酶量作用于小麦麸皮时生成的还原糖量。结果表明,乙酰木聚糖酯酶与第11家族木聚糖酶有更好的协同作用,并在添加量比(酶活力比)为5∶1时所测协同效果最好,还原糖生成量较木聚糖酶单独作用增加了46%。因此,在乙酰木聚糖酯酶的作用下,木聚糖上乙酰基的去除,对提高木聚糖酶对木聚糖的水解效率具有重要作用。     

链霉菌DDE转座酶基因的克隆及生物信息学分析

从实验室保藏的菌株中筛选出一株产DDE转座酶的菌,经形态及生理生化、16S rDNA及建树分析比对,该菌株属链霉菌属灰褐类群,暂将其命名为Streptomyces labedae sp. X1。从Streptomyces labedae sp. X1基因组DNA扩增一401 bp的DDE转座酶基因,通过Blast和ISfinder数据库进行序列比对,结果显示其与ISAzo13家族转座酶的基因有88%的相似度。通过对其进行生物信息学分析,发现该基因可编码133个氨基酸,且该DDE转座酶的保守的氨基酸三联体分别位于Asp43、Asp49、Glu91上,理化性质结果显示编码产物为稳定的亲水蛋白;二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,不存在信号肽和跨膜结构域,为非分泌蛋白;有14个磷酸化位点且仅有一个糖基化位点;高级结构以α-螺旋为主;通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示在27 ku处出现条带。该研究结果为研究链霉菌DDE转座酶基因的表达机制提供了重要信息,对以后鉴定DDE转座酶活性以及它的结构和功能奠定基础。     

芽孢杆菌植酸酶基因的克隆及生物信息学分析

采用PCR技术从Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061中克隆到植酸酶的全长基因phyC(1152bp),并将该基因成功克隆到表达载体pET22b(+),经PCR鉴定和DNA测序证明,pET22b(+)-phyC重组质粒构建成功。将该酶的氨基酸序列在Swiss-prot数据中进行BLAST比对发现,该序列未见报道,其与来自Bacillus subtilis的植酸酶序列(Swiss-prot ID: O31097)最相似,序列一致性为98.7%。分析可知该氨基酸序列在位点为128、144、153、257和370处分别变异为Ala、Ile、Ser、Pro和Lys。运用SignalP 3.0服务器对其信号肽进行预测,表明该酶N端1～26个残基可能是信号肽序列。运用SWISS-MODEL服务器进行同源建模,经PROCHECK V3.5软件对其Ramachandran plot、G-factor等进行评价,结果显示结构模型中的键长、键角及二面角的分布及结构合理。该基因已在GenBank上登录(登录号为HM747163)。     

微紫青霉酸性木聚糖酶xynA基因的克隆与序列分析

基于酸性木聚糖酶在饲料及酿酒行业良好的应用前景,通过基因组步移的方法克隆得到微紫青霉酸性木聚糖酶的全长基因xynA,然后采取重叠延伸PCR技术进行内含子的切除获得xynA的cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。序列分析结果显示xynA基因全长720 bp,内含子63 bp,cDNA全长657 bp。推测该木聚糖酶编码信号肽28个氨基酸,成熟肽190个氨基酸;预测该蛋白为分子质量20.61 kD、等电点7.0的亲水性蛋白,且分子内不含二硫键。与其他真菌来源的GH11族耐酸性木聚糖酶进行序列比对,结果显示该酶的相应位置具有特征天冬氨酸残基Asp,且具有糖苷水解酶11族的保守区域特征以及典型的"右手半握"状结构,重组木聚糖酶基因xynA能够在大肠杆菌中成功表达,比酶活力达220.5 U/mg。     

宇佐美曲霉环氧化物水解酶基因的克隆与生物信息学分析

环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase,EH)是酶法拆分消旋体环氧化物,制备光学活性环氧化物和邻二醇的重要酶之一。通过RT-PCR和新构建的THSO-PCR侧翼未知DNA序列扩增技术,克隆了一种来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的EH基因,命名为Aueh2(GenBank No.KF061095),并对该基因进行了相关生物信息学分析。Aueh2的DNA序列长度为2 481 bp,其中包含了5′端和3′端侧翼调控序列,6个内含子序列和编码cDNA序列。开放阅读框序列长度为1 188 bp,编码395个氨基酸,对应的蛋白质命名为AuEH2;该蛋白质为无信号肽的亲水蛋白质,其理论相对分子质量44.6 kD;其三维结构包含EH典型的"α/β"核心催化结构域和"帽子"结构域,活性中心由催化三联体Asp191、His369和Glu343组成。本课题研究成果为深入研究AuEH2及其应用奠定了基础。     

Mechanism of Amylolytic Starch Degradation

The molecular mechanism of amylolytic enzymes has been investigated by differrent methods using amylose, pancreatic and Bac. subt.-a-amylases and amyloglucosidase. From the data obtained the following conclusions are drawn: The fitting between substrate and enzyme is induced by the C 3 hydroxyl groups of the substrate. In the course of the fitting hydrogen bonds arise between these hydroxyl groups and those of the enzyme molecule which possess the highest cohesion increment. A new theory is proposed for explaining the high catalytic effectivity of amylolytic enzymes.     

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸转运蛋白基因的克隆与分析

该研究旨在克隆变形假单胞菌JUIM01的2-酮基葡萄糖酸转运蛋白基因kgu T,并明确其基本的生物学信息。根据已报道的假单胞菌的基因组信息及其2-酮基葡萄糖酸操纵子的物理图谱设计简并引物,采用TD-PCR技术从变形假单胞菌中克隆到全长为1278 bp的kgu T,其核苷酸序列与Pseudomonas sp.CCOS191的编码2-酮基葡萄糖酸转运蛋白(Kgu T)的核苷酸序列的一致性为87%,编码一个由425个氨基酸残基组成的蛋白。该蛋白与Pseudomonas sp.M1的Kgu T在氨基酸序列上的一致性达90%,定位于细胞膜,是一个具有12个跨膜结构的疏水性的跨膜蛋白,无信号肽,其二级结构中α螺旋、延伸链和无规卷曲所占的比例分别为75.76%、2.12%和22.12%。本研究首次从2-酮基葡萄糖酸的工业生产用菌中克隆到基因kgu T,并对其进行了生物信息学分析,为变形假单胞菌的Kgu T的功能研究奠定了基础。     

圆弧青霉脂肪酶基因序列的生物信息学分析

从圆弧青霉PG37中克隆了碱性脂肪酶(Lip I)基因,并采用生物信息学分析了PG37 Lip I基因携带的遗传信息.序列分析结果表明:Lip I DNA序列全长1 480 bp,不存在重复序列,含有5个内含子,5' 端存在TATA box和多个转录因子结合位点;cDNA序列全长1 128 bp,包含了转录起始位点、5' 和3' 非编码区及858 bp的开放阅读框架;Lip I编码区对TGC、GAC、TTC、CAC、AAG、AAC和TAC这7种密码子使用频率最高;比对Lip I基因与Pichia pastoris基因组中的密码子使用频率,其中有21个密码子使用频率的比值相差较大.     

鼠李糖乳杆菌L-乳酸脱氢酶的生物信息学分析和基因克隆

本研究以鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）L-乳酸脱氢酶（Lr-L-LDH）为研究对象,以研究较多的Lr-L-LDH1为对照,对基因组注释的两个Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2基因,进行异同分析。采用在线网站和专业软件对Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2的一级结构、基本特性、亲疏水性、二级结构进行分析和预测,对三级结构进行同源建模以及酶和底物的分子对接分析,并对酶的编码基因进行系统发育分析,克隆表达及酶活性检测。结果显示：相较于Lr-L-LDH1,Lr-L-LDH2有着相似的分子特性,二级和三级结构,但Lr-L-LDH2编码序列短,氨基酸序列同源性低（48.08%）,有不同的进化地位;Lr-L-LDH2也含有乳酸脱氢酶催化活性位点序列和保守的NAD+结合位点序列（GXGXXG）,能够形成典型的活性三维口袋域,是NAD+依赖型四聚体结构L-乳酸脱氢酶,在细胞中需要果糖1,6-二磷酸（FBP）来激活,催化丙酮酸还原为L-乳酸;体外克隆表达和酶学分析表明,Lr-L-LDH2酶活力极显著低于Lr-L-LDH1(P<0.01)。Lr-L-LDH1和Lr...