DNA 提取方法对实时荧光定量 PCR 检测花生过敏原 Ara h 2 基因的比较研究

目前,食物过敏是一个世界性的公共卫生问题,其中花生过敏最为严重。基于DNA的分子生物学检测方法目前已广泛应用于花生过敏原检测,样品DNA的提取质量会显著影响检测的灵敏度及准确率。本研究比较了5种DNA提取方法,包括十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）法、柱式法及3种基于磁珠纯化技术的DNA快速提取法,对生花生、煮花生、炸花生、烤花生、花生酥和花生酱6种不同加工方式的花生基质样品进行DNA提取,考察了不同方法获得的DNA浓度、纯度指标,并采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）对花生过敏原Ara h 2基因进行了检测分析。结果表明,月桂酰肌氨酸钠（Sodium Lauroyl Sarcosine）磁珠法（简称SLS磁珠法）的适用性广、提取率高,对于6种花生基质提取的DNA均能高效检出花生过敏原Ara h 2基因;对于花生含量为0.05%～1.00%的小麦粉二元混合物,SLS磁珠法的DNA提取率总体优于CTAB法,并且能有效提取出与花生共用一条生产线的燕麦片中污染的花生DNA,证实SLS磁珠法提取的实际样品DNA能够满足花生过敏原检测目的。本研究为花生及其制品DNA提取方法提供了参考,特别是磁珠类方法,高效快速,提取质量能够保障后续基于DNA的花生过敏原分子生物学方法检测结果的准确性。     

基于全自动核酸提取的荧光定量PCR鉴别羊肉制品真伪

摘要：目的 建立一种基于自动化的快速核酸提取方法,联合三重实时荧光定量PCR技术,提高羊肉制品真伪鉴别的检测效率。方法 分别采用全自动核酸提取法、磁珠手提法与柱提法对不同状态羊肉制品进行核酸提取,比较不同方法的提取时间差异,通过三重实时荧光定量PCR扩增结果评估不同方法的提取效果。以国标法为对照,对市售的羊肉制品进行平行检测,评估本方法的检测性能。结果 与磁珠手提法、柱提法相比,全自动核酸提取法的提取时间缩短了15-30 min,且提取的核酸扩增效果更好。全自动核酸提取法在羊猪混合样本中羊源核酸检出限为0.010 mg·g-1。全自动核酸提取法在生鲜肉、生肉及熟肉制品等多种类型产品中提取的羊源核酸PCR检测结果的CV值均<3.000%。分别采用三重实时荧光定量PCR法与国标法对全自动提取的21份市售的涵盖不同类型的羊肉制品核酸进行平行检测,符合率为100.00%。结论 本研究方法可为羊肉制品掺假的快速真伪鉴别提供操作简便、稳定灵敏、快速准确的整套解决方案。     

改良十六烷基三甲基溴化铵-磁珠核酸提取方法及在植物转基因检测中的应用

目的 建立一种快速、高效、便捷的植物基因组DNA提取方法并运用于植物转基因检测。方法 改良传统的十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium ammonium bromide, CTAB)方法, 并结合磁珠吸附基因组DNA, 配合核酸自动提取系统提取水稻和加工米粉中的核酸, 荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测Bt63大米转基因成分, 并与另外4种提取方法的结果进行对比, 评价提取效果。结果 5种不同方法中CTAB-磁珠法提取的样品基因组DNA浓度和质量最佳, 荧光PCR检测低浓度Bt63转基因成分(0.01%)的Ct值最小, 检测结果最好。结论 该方法可高效快速地提取植物核酸, 在低含量的转基因成分检测中相比其他几种方法具有绝对优势。     

玉米变性淀粉两种不同DNA提取方法的比较研究

采用两种不同方法对玉米变性淀粉基因组DNA提取比较,并经特异性引物进行实时荧光定量-聚合酶联反应(qRT-PCR)检测,从中选择出更适合玉米变性淀粉后续转基因成分检测的DNA提取方法。通过采用磁珠法和试剂盒法提取玉米变性淀粉基因组DNA,比较不同方法的提取效果。结果表明,试剂盒法的提取效果优于磁珠法。实时荧光定量PCR结果显示,试剂盒法提取的基因组DNA均可扩增出标准的S形曲线,而磁珠法提取的基因组DNA则无任何扩增信号。该研究为检测玉米变性淀粉中的转基因成分奠定了基础。     

基于裸磁珠的金黄色葡萄球菌富集优化

本文研究了裸磁珠对金黄色葡萄球菌吸附效果,优化吸附条件,研究金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液的吸附情况,最终将其应用于牛肉样品中金黄色葡萄球菌的检测。通过实验,优化裸磁珠吸附菌体的最小磁珠用量,最小吸附体积和最短吸附时间,并分析是否满足荧光PCR检测需要。结果表明:裸磁珠对浓度为102～107 cfu/mL金黄色葡萄球菌的吸附率在95%以上,有较好吸附效果;10 mg裸磁珠在5 mL菌液中吸附10 min,从磁珠上提取的DNA浓度和纯度可以满足荧光PCR的检测要求;裸磁珠在混合菌体中吸附到的金黄色葡萄球菌可以被荧光PCR检测出来,裸磁珠在牛肉样品中吸附浓度为102 cfu/mL金黄色葡萄球菌提取的DNA可以被荧光PCR检测出来。因此,裸磁珠可用于食品中金黄色葡萄球菌的富集,满足荧光PCR检测菌体量要求。     

不同烹饪方式对海鲈鱼品质和风味的影响

为探讨烹饪方式对海鲈鱼品质和风味的影响,研究了蒸、煮、烤3种不同烹饪方式对海鲈鱼色泽、质构特性及挥发性成分的影响。结果表明:蒸、煮、烤3种烹饪方式对L*值无显著影响,对a*值有显著影响(P0.05)。与蒸制和烤制相比,煮制的海鲈鱼b*值有显著变化(P0.05)。烹饪方式对海鲈鱼的弹性和回复性无显著影响,对其硬度和咀嚼性有显著影响(P0.05),煮制时硬度和咀嚼性数值较大。与蒸制和烤制相比,煮制的海鲈鱼粘聚性显著增大(P0.05)。电子鼻能够较好地区分不同烹饪方式海鲈鱼制品的风味。气相色谱-质谱法分析表明,从生的海鲈鱼样品中鉴定出23种挥发性化合物,在蒸、煮、烤3种烹饪方式处理的海鲈鱼样品中,检测出的挥发性化合物种类分别为7种、18种和23种,主要由醛类、烃类、醇类和苯类等组成。     

植物源性食品DNA提取方法的建立及几种方法比较

以大豆和马铃薯植物源性食品为研究对象,比较了研究所建立的基于磁珠的DNA提取方法、3种商品试剂盒法和传统CTAB法共5种方法提取各种食品基因组DNA的效果;通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分析法、定性PCR和实时荧光定量PCR法对所提取的DNA进行检测,比较所得DNA的浓度和纯度,以及对下游检测的适用性。结果表明,与其他几种提取方法相比,研究所建立的方法提取到的DNA浓度稍低,但纯度较高,而且对于豆油和淀粉样品,可很好地提取到基因组片段,满足后续PCR检测要求。     

速冻面米制品中金黄色葡萄球菌DNA提取方法的比较分析

DNA的提取效率是影响食品中致病菌PCR检测的关键因素。以速冻面米制品中最易污染的金黄色葡萄球菌为研究对象,比较4种DNA提取方法(CTAB法、离心柱法、氨基化纳米磁珠法、羧基化纳米磁珠法)的效率和质量,对提取的DNA采用荧光定量PCR方法评价。结果表明,在三大类速冻面米制品(肉馅类、素馅类和无馅类)人工污染金黄色葡萄球菌的样品中,羧基化纳米磁珠法和氨基化羧纳米磁珠法的提取效率显著优于CTAB法和离心柱法,可推荐为速冻面米制品中金黄色葡萄球菌污染快速定量检测的DNA提取方法 。     

磁珠法提取植物蛋白饮料DNA

目的 建立一种快速、高效的植物蛋白饮料基因组DNA提取方法并应用于植物蛋白饮料中植物源性成分的检测。方法 以豆浆、豆奶、芝麻糊、花生牛奶、榛子乳5种植物蛋白饮料为研究对象, 建立利用硅羟基磁珠提取植物蛋白饮料DNA的方法, 通过分析所提取DNA的浓度和纯度, 实时荧光PCR扩增效率, 并与十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium ammonium bromide, CTAB)比较, 综合评价磁珠法提取植物蛋白饮料的效果。结果 大部分样品磁珠法提取的DNA浓度比CTAB法高, ODA260/A280均大于1.70。 结论 磁珠法提取的DNA纯度较高, 杂质少, 能满足植物蛋白饮料源性成分的分析要求, 尤其适用于大豆类蛋白饮料的DNA提取, 为快速、高效获取质量好的植物蛋白饮料基因组DNA提供参考。     

几种提取转基因木瓜DNA的方法比较

目的 比较CTAB法、SDS法及试剂盒法分别提取木瓜果皮、果肉、种籽DNA的效果, 以提高转基因木瓜的检测准确率。方法 对转基因木瓜内源基因Papain及外源基因NPTII、CP进行普通PCR, 同时对基因表达零件CaMV35S启动子和NOS终止子进行荧光PCR, 以检测提取DNA的质量。结果 分析电泳产物发现, SDS法提取木瓜种籽样品的DNA未能适合普通PCR检测的要求, 其他方法均能满足普通PCR要求。荧光PCR结果显示, 3种方法提取的DNA都满足荧光扩增要求。结论 比较3种提取方法及3种木瓜材料, 发现用CTAB法或SDS法以果皮为材料提取DNA质量最佳。     

肉制品中志贺氏菌DNA的快速提取方法

肉制品中致病菌DNA的提取对PCR检测具有重要意义。以污染志贺氏菌的猪肉为材料,比较了沸水浴法、裂解液煮沸法、CTAB/SDS法、改良的碱性异硫氰酸胍法4种提取方法对志贺氏菌DNA的提取效果,并以提取的DNA为模板进行PCR检测。结果表明:改良的碱性异硫氰酸胍法提取志贺氏菌DNA的效果较好,猪肉中志贺氏菌的PCR最低检出限为5×100CFU/g,整个检测时间<8h。经改良的碱性异硫氰酸胍法操作简便、经济省时,可用于肉类的PCR检测。     

基于磁性纳米粒子的粮油制品真伪鉴别技术研究

通过PCR检测食用油中内源性DNA是鉴定食用植物油品种真实属性,检测食用油掺假的一种有效方法。然而由于精炼的食用油中DNA含量极低,如何有效富集食用油中的DNA是实现PCR鉴别粮油的关键。因此,作者研究了磁珠法富集食用油中的DNA并通过实时荧光PCR检测芝麻油、菜籽油、稻米油的内源基因。结果表明经过5次乳化后和磁珠进一步富集水相中的DNA,实时荧光PCR成功检测到了食用油中的内源性基因,琼脂糖凝胶电泳分析进一步证明实现了上述3种食用植物油的定性鉴定。     

基于COI序列的DNA微条形码技术鉴别熟肉制品中11种肉掺假的研究

建立并优化了基于COI序列的DNA微条形码技术(mini-barcoding)检测熟肉制品中11种常见肉类掺假的方法.样品经超声与真空冷冻干燥处理,提取DNA模板和PCR扩增后,目标扩增物经切胶纯化后进行克隆测序,并将测序结果提交GenBank数据库Blast比对.筛选出适合猪、牛、羊、鸡、鸭、鸽子、马、驴、鹅、兔、鼠...     

肉制品中牛源性成分多重实时荧光PCR检测 方法的建立及初步应用

目的建立肉制品中牛源性成分的荧光PCR检测方法。方法根据牛特异性线粒体DNA片段,设计合成两对引物,以生、熟牛肉及超市牛肉加工品为材料,建立肉制品中牛源性成分的多重实时荧光PCR检测方法,并用该法与国标法同时对市售的25份肉制品同时进行检测,通过对其他种类的肉源DNA进行扩增验证方法的特异性;对含有不同比例牛肉成分的DNA样本进行检测确定检出限。结果该方法可成功检测出肉制品中的牛源性成分。在25份肉制品检测中,与国标法检测结果一致。该法的特异性为100%,灵敏度检测线为1%。结论本研究成功建立牛源性肉制品的检测方法,该方法快速简便,且具有较高的特异性和灵敏度,可用于市售肉制品中牛源性成分的鉴定。     

盐干海参的2种核酸提取方法比对及其分子鉴定

目的 建立盐干海参的核酸提取及其分子鉴定方法。方法 选取5种盐干海参, 采用直接处理、洗涤处理和浸泡处理3种处理方式, 比较磁珠法和离心柱法两种核酸抽提方式的提取质量, 并采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)法对提取的核酸进行分析确认。结果 同一种抽提方式不同海参处理组间核酸质量没有显著差异, 而两种抽提方式间核酸质量差异显著, 其中磁珠法提取的核酸得率高、纯度高, 而离心柱法提取的核酸得率及纯度均偏低。经PCR扩增验证, 磁珠法提取的核酸效果较佳。将扩增产物进行测序及系统进化分析发现5种海参实际种类与标注名称仿刺参存在较大差异。结论 盐干海参处理方式对核酸提取结果影响不大, 磁珠法提取核酸效果较好,单纯依靠COI和16S rRNA基因通用引物并不能对所有的海参种类进行鉴定。