重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中融合可溶表达

将N-利用基质(NusA)和人骨形态发生蛋白-2成熟肽(hBMP-2m)的编码基因进行基因融合,实现了hBMP-2m在大肠杆菌中的融合可溶表达.以大肠杆菌基因组DNA为模板PCR扩增得到NusA基因,通过NdeⅠ和AflⅡ酶切位点将其置换出重组融合表达载体pDsbA-hBMP-2m中的DsbA基因,使hBMP-2m基因重组于NusA基因的下游,重组质粒转化E.coli BL21(DE3),获得工程菌.在30℃条件下,经IPTG诱导表达后,融合蛋白占细胞总蛋白的45%左右,并且主要以可溶形式存在,可溶部分达90%以上.经过简单的Ni 2+柱一步纯化即可得到纯度较高的融合蛋白.通过融合表达的方式表达出可溶性的目的蛋白,有望复性后通过肠激酶酶切得到hBMP-2m单体,进一步二聚体化得到具有生物活性的hBMP-2m.     

蜡样芽胞杆菌深圳株754-1 PLC基因的克隆及表达

以本实验室分离筛选的高产PLC的蜡样芽胞杆菌深圳株754—1为供体菌，以大肠杆菌DH5仅和BL21（DE3）为受体菌，构建高效表达胞内PLC的工程菌。以754-1菌基因组为模板。经PCR扩增，将得到的PLC基因连接到T载体上，转入大肠杆菌DH5仅。经Amp抗性筛选的阳性克隆子提取重组质粒，双酶切，回收含PLC基因的片段并将其克隆到pGEX-KG载体，获得重组质粒pGEX-KG-PLM，该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。用IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析，在分子量为38kd处有一条明显的表达带。     

GLP-1毕赤酵母表达载体的构建及重组菌株的筛选

选择了一种人胰高血糖素样肽(GLP)-1作为研究对象,全基因合成GLP-1基因序列,用限制性内切酶Xba I和Xho I双酶切合成后的pUC57质粒获得目的基因。以XbaI和XhoI双酶切表达质粒pPICZαA,将目的基因与表达质粒pPICZαA用T4连接酶连接,构建pPICZαA-GLP-1质粒,转入毕赤酵母GS115。合成的目的基因序列为128bp,用GLP-1特异性引物扩增阳性重组子,得到120bp左右的片段。将此特异性片段扩增回收,测序发现确为GLP-1基因,表明成功转入毕赤酵母中。为进一步研究GLP-1在毕赤酵母中的高效表达奠定了坚实的基础。     

半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件

从嗜热脂肪芽孢杆菌(IAM11001)中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB,构建具T7强启动子的PET-20-(b)-BgaB质粒，并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，经IPTG诱导的后，重组菌周质中乳糖酶酶活达到0.12U/mL，胞内酶活为1.35U/mL，比酶活为6.66U/mg蛋白，比酶源菌产生的酶活提高5倍，通过对IPTG诱导时机，诱导浓度和诱导时间的优化研究，重组细菌产生的比酶活进一步提高至酶源菌的90倍。     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因定向进化研究

为得到具有催化活性的重组亚油酸异构酶,对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株亚油酸异构酶基因进行体外定向进化.经过两轮连续易错PCR扩增及一轮DNA改组获得了突变基因片段,并克隆到pET30a质粒载体上,转化大肠杆菌,构建了该酶的基因突变文库.经IPTG诱导表达后筛选出一株重组菌,可表达可溶性重组酶蛋白,经紫外分光光度计法测定,重组酶蛋白活力为8.2 U.     

人参皂苷葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及包涵体的变复性

将人参皂苷葡萄糖苷酶的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。对该基因进行诱导表达,并对包涵体进行变性和复性。结果显示,经终浓度为0.5mmol/L IPTG在30℃下诱导表达4h,进行SDS-PAGE分析,目的蛋白主要以包涵体形式存在并确定其分子质量约为75ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。包涵体经过变性和稀释复性后,经TLC活性检测,能够水解底物Rb1,表明具有人参皂苷葡萄糖苷酶的活性。     

HPV16 E6基因原核表达质粒的构建

对构建HPV16 E6基因的原核表达质粒pET28a(+)-HPV16 E6进行研究.从宫颈癌细胞株CaSki细胞中提取的的DNA基因组为模板,设计一对特异性引物,用PCR法扩增出HPV16E6基因片段.HPV16E6基因片段和质粒pET28a(+)经NcoⅠ和HindⅢ双酶切后用T4 DNA连接酶连接.构建的重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6转化大肠杆菌DH5α,经PCR鉴定和酶切鉴定筛选出阳性克隆,将阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌BL21 Star-DE3 Plyss中,构建了HPV16 E6基因原核表达质粒pET28a(+)-HPV16E6.HPV16E6基因原核表达质粒pET28a(+)-HPV16 E6的构建为HPV16 E6重组蛋白的制备和为宫颈组织HPV16型感染的早期诊断和相关治疗性疫苗的研制奠定了物质基础.     

β-琼脂糖酶（AgaA7）在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质研究

为研究重组β-琼脂糖酶（AgaA7）基因的表达产物及其酶学性质,根据GeneBank中β-琼脂糖酶（AgaA7）基因的编码序列合成此基因后,将其克隆到表达载体pET-22b（＋）中,并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达.纯化后的表达产物经SDS-PAGE检测其相对分子质量并测定其酶学性质.结果表明：重组酶的相对分子质量为～5.0×10^4,与预期相符.此酶最适反应pH是7.0,在pH58的缓冲液中最稳定;最适反应温度为50℃,在低于50℃时比较稳定.Na^＋,K^＋,Ca^2＋,Mg^2＋对重组酶活性影响不大,而Zn^2＋,Hg^2＋,Pb^2＋则对酶活性具有不可逆抑制作用.     

里氏木霉Swollenin在毕赤酵母中的表达

通过设计合适的引物,经RT-PCR方法从里氏木霉的总RNA中扩增出Swollenin基因,并将该基因连接到PMD18-T Simple载体,得到该基因的克隆菌株,经酶切并将该基因连接到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαA,得到重组质粒pPICZαA-swo1.将该重组质粒线性化后,通过电转化方法转化毕赤酵母GS115,得到重组菌株P. pastoris-swo1.该菌株的发酵液可使滤纸纤维强度降低,纤维素膨胀及崩解效果明显,表明重构表达的Swollenin可用于木质纤维素的预处理.     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶在毕赤酵母中的分泌表达

以嗜酸乳杆菌AS1.1854来源的亚油酸异构酶基因为模板,用PCR方法扩增目的片段,并克隆到pMD19T载体.经双限制性酶切的pMD19T-LAI和载体pPICZαA连接转化得到重组质粒pPICZαA-LAI.将阳性重组质粒用sac Ⅰ进行线性化后,经化学法转化毕赤酵母GS115.提取重组酵母GS 115/pPICZαA - LAI基因组,利用交叉引物通过PCR方法筛选重组子.阳性毕赤酵母GS115/pPlCZαA-LAI经1％甲醇诱导,分泌表达出相对分子质量为69 000亚油酸异构酶.经测定发酵上清酶活力为0.107 U,未破碎重组酵母酶活力0.08 U.     

哈茨木霉Chiv基因的原核表达及优化

通过筛选哈茨木霉的DNA文库,克隆到Chiv基因的cDNA全长序列.以连接有哈茨木霉Chiv基因的质粒pBK902为模板,设计含有EcoRI和XhoI酶切位点引物,采用PCR方法扩增得到具有完整开放阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上并转化大肠杆菌BL21菌株中,成功地获得了大量的阳性转化子.质粒通过EcoRI和XhoI酶切鉴定及测序鉴定,证明Chiv基因成功地转化到大肠杆菌中.重组大肠杆菌经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现特异的蛋白表达条带,其分子量为50 kDa左右.通过对诱导剂量与诱导时间等因素的优化,结果显示几丁质酶的最佳诱导时间为13 h,最佳诱导剂浓度为1 mM,为几丁质酶的工业化生产奠定基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)VR2332株ORF7的全长基因序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR扩增出完整的ORF7基因,并将PCR产物克隆至pMD-18T载体进行测序分析.双酶切测序后重组质粒pMD-18T-N得到目的片段连接至原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-N....     

重组猪IFNα的构建及原核可溶性表达研究

使用原核表达系统可溶性表达猪α-干扰素,并进行纯化和鉴定。根据Gene Bank中报道的猪α-干扰素成熟肽基因序列设计引物,以猪肝脏细胞基因组DNA为模板,用PCR方法扩增猪α-干扰素成熟肽基因,并将其定向克隆到原核表达载体pET32a+中,转化大肠杆菌DH5a。阳性克隆经PCR鉴定、双酶切鉴定以及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21进行诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE分析、镍柱亲和层析纯化、Western-blot鉴定。结果表明:成功构建了猪α-干扰素原核表达载体pET32a+-poIFN-α;表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约3.8×104的位置出现了目的蛋白条带,与预期相符;Western-blot鉴定显示有特异性条带出现。实现了重组猪α-干扰素的可溶性表达,获得了纯度较高的重组猪α-干扰素,为进一步研究其药物作用奠定了基础。     

黑曲霉bgl基因在毕赤酵母中的表达研究

为构建具有分泌黑曲霉β-葡萄糖苷酶活力的酵母工程菌,探讨β-葡萄糖苷酶基因(bgl基因)在酵母菌中的表达情况.克隆了黑曲霉bgl基因的cDNA片段,利用质粒pPICZαA构建了该基因的酵母表达载体,经线性化后采用电穿孔法转入毕赤酵母菌中.以甲醇为诱导物进行诱导培养,检测结果表明黑曲霉bgl基因已成功转入酵母菌中并可正常表达,重组蛋白具有β-葡萄糖苷酶水解活性,在诱导培养72 h后,发酵液的酶活力可达到0.78 U/mL.     

耐热β-半乳糖苷酶基因bgαB在枯草芽孢杆菌中的整合表达

来源于嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillus stearothermophilus的耐热β-半乳糖苷酶基因bgαB被克隆到大肠杆菌—枯草芽胞杆菌穿梭质粒pMA5中，然后将外源基因及其表达调控序列亚克隆到枯草芽胞杆菌整合栽体pSAS144中，转化Bacillus subtilis受体菌BD170，在5μg／mL的氯霉素抗性平板上筛选抗性转化子，经摇瓶发酵后，得到耐热乳糖酶的比酶活为0．32U／mg，是出发菌株比酶活的2倍。     

哈茨木霉几丁质酶基因的cDNA克隆及表达

为了研究全新几丁质酶基因Chit37(DQ647957)的特性与功能,将该基因在大肠杆菌中进行了外源表达.通过构建哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了基因Chit37的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为1032bp,编码343个氨基酸,理论分子量为36.6kDa.采用PCR扩增的方法克隆该基因并将其构建到原核表达载体pET28(a+)上,构建了原核表达载体pET-Chit37并转化宿主菌BL21(DE3),菌落PCR及酶切鉴定均证实转化子的正确性,重组蛋白经IPTG诱导后获得表达.优化的表达条件为终浓度0.1mM IPTG诱导培养4h.     

酸性β-半乳糖苷酶基因密码子优化及高效表达

选用酵母偏好密码子,设计合成一种酸性β-半乳糖苷酶基因,并研究其在毕赤酵母中的高效表达。优化后,密码子适应指数(CAI)由原来的0.61提升到0.85。在基因的5'端融合编码α信号肽序列,在3'端融合编码6个组氨酸标签序列,并在N端编码α信号肽和编码成熟酸性β半乳糖苷酶基因间分别引入编码kex2和Ste13裂解信号序列。基因克隆到pPICZα-A表达载体,构建成分泌型重组酵母表达载体pPICZα-β-Gal。在醇氧化酶(AOX1)启动子调控下,酸性β-半乳糖苷酶得到高效分泌表达,达到508 mg/L,比优化前提高3倍。重组酸性β-半乳糖苷酶具有天然的酸性β半乳糖苷酶相同的酶活性。     

Lrrcl0蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET～Lrrcl0和Lrrcl0蛋白表达,利用NcoI和BamHI双酶切载体pMDl8-T-Lrrcl0,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a（＋）,转入E．colistrainDH5d．茵落PCR筛选阳性茵落,提取阳性茵质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E．colistrainB121（DE3）,于37℃振荡培养,用1mmol／LIPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrcl0。转入E．colistrainBL21（DE3）进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrcl0;Lrrcl0蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

大肠杆菌分泌表达纳豆激酶及体外溶栓特性分析

以Bacillus subtilis NK4基因组为模板,克隆出纳豆激酶(Nattokinase, NK)前导肽与成熟肽编码基因(NK),并采用同源重组方法将其与已报道的功能肽编码基因Cel或Fe及线性化质粒pET-22b构建出重组表达载体pET22b-Cel-NK与pET22b-Fe-NK,并转化于E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达。经IPTG诱导表达后,实现了重组NK在大肠杆菌中的重组表达并具有生物活性,但SDS-PAGE仅检测到重组酶Cel-NK的可分泌表达及其具有酶催化活性,酶活力为(3.36±0.56) IU/mL,体外溶栓实验也表明该重组酶NK具有良好的体外溶栓效果,表明Cel有助于介导蛋白NK可活性分泌表达。